胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段血清蛋白質(zhì)指紋圖譜及意義研究.pdf

1、我國胃癌發(fā)病率和死亡率占所有惡性腫瘤中的比率在農(nóng)村為第一位，在城市為第二位，每年約有20萬人死于胃癌。目前依靠胃鏡檢查是發(fā)現(xiàn)早期胃癌的有效手段，但胃鏡檢查存在諸多不便。尋找一種簡單易行、靈敏度高、特異性強的早期胃癌診斷方法是當務之急。胃癌器官轉移率國內(nèi)報道為64.2％，其中男性以肝轉移最多38.1％，女性則以卵巢轉移多見43.6％。臨床診斷肝轉移的胃癌病例平均生存期僅為5.5個月；臨床診斷卵巢轉移的胃癌病例66％生存期僅為半年。因此，如

2、何解決胃癌肝轉移、卵巢轉移早期診斷和防治的難題。 表面增強激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF)技術是新發(fā)展的蛋白質(zhì)組學分析技術。根據(jù)定位于芯片表面物質(zhì)的性質(zhì)不同，可將所用芯片分為化學型芯片和生物型芯片。近兩年來，該技術在差異蛋白質(zhì)組學、蛋白質(zhì)分子相互作用、疾病診斷等方面得到了廣泛應用，為差異蛋白質(zhì)組學研究提供了強有力的技術平臺。 (一)臨床病例資料及血清標本收集： 1.臨床病例資料：收集2004-2

3、005年診斷證實的胃癌患者57例，男：女39：18；年齡42-84歲，平均年齡60±15.3歲；組織學分型及分化程度(34例)：高分化腺癌7例；中分化腺癌10例；低分化腺癌11例；印戒細胞癌6例。臨床病理分期:早期胃癌19例，進展期38例。將本組病例分為3組：早期胃癌組(19例)、不伴臟器轉移之進展期胃癌組(25例)、伴臟器轉移之進展期胃癌組(12例)。解放軍306醫(yī)院提供除胃以外的消化道癌肝轉移患者9例，用于與本組胃癌肝轉移做比較分析

4、。收集沈陽軍區(qū)總醫(yī)院、中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院經(jīng)胃鏡活檢及病理確診的胃良性病患者7例，其中不典型增生2例，慢性萎縮性胃炎2例，胃息肉1例，胃潰瘍2例。解放軍306醫(yī)院提供健康者30例。 2.血清標本收集：采集患者接收治療前早晨空腹靜脈血，靜置凝結，于2500rpm離心5min，分裝血清，凍存于-70℃冰箱中備用。 (二)儀器、材料及蛋白質(zhì)芯片檢測方法 1.儀器、芯片及主要試劑：表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(

5、SELDI-TOF，美國Ciphergen公司)，化學修飾的WCX2芯片。所用尿素、乙腈、三氟乙酸、Tris-HCI pH9.0、CHAPS、DTT、NaAc、HPLC H2O、Hepes等均購自Sigma公司。 2.血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測方法：血清樣品前處理：取3μl血清加6μlU9處理液(pH9.0)，充分混勻，冰浴振蕩30min，加入108μl結合緩沖液(100mmol/LNaAc,pH4.0)，立即混勻。上樣及洗脫：將WCX

6、2芯片裝入bioprocessor中，每孔加入200μl結合緩沖液，室‘溫振蕩洗滌2次，5min/次，甩干。每孔分別加入100μl樣品混合液，振蕩孵育1h，甩去樣品，用200μl洗脫緩沖液(100mmol/LNaAc，pH4.0)室溫振蕩洗滌2次，5min/次，甩干；再用HPLC H2O洗滌1次，立即甩干。拆開bioproceessor，取出芯片，晾干后，每點加2次0.5μl SPA，晾干后上機檢測。 3.數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計學處理：

7、采用蛋白飛行質(zhì)譜儀(PBSH-C型)對結合在WCX2芯片上的血清蛋白進行讀取分析，設定最高檢測分子量為50kD，優(yōu)化范圍為2kD-20kD，激光強度190，檢測敏感度為8，將1kD以下的峰濾去。采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù)，用質(zhì)譜峰下面積表示蛋白質(zhì)豐度。采用Biomarker Wizard軟件分析蛋白質(zhì)指紋圖譜，確定兩組間蛋白峰值的差異。在對數(shù)據(jù)進行t檢驗時，P<0.05視為差異具有統(tǒng)計

8、學意義。 (三)早期胃癌樹狀分類模型建立及盲篩評估方法： 1.早期胃癌預警決策樹分類器模型初步建立 1.1參與訓練、建模的病例資料：在本組病例中隨機挑選30例胃癌患者(早期10例、進展期中不伴臟器轉移14例、伴遠隔臟器轉移6例)及30例正常對照作為訓練組參加建模。 1.2早期胃癌預警決策樹分類器模型建立方法與主要步驟： 建模方法：采用Ciphergen公司Biomarker Patterns So

9、ftware初步建立早期胃癌預警決策樹分類器模型。建模中采用Cini分布索引方法形成CART決策樹(分類和回歸樹)，同時選用決策樹袋法，以克服向前可變選擇過程中(如決策樹)的不穩(wěn)定性，并提高總體分類性能。 建模主要步驟：選擇篩選的早期胃癌與正常對照組之間的49個差異蛋白質(zhì)峰信號簇構成決策樹，按49個質(zhì)點的高維特征將其劃分為小的矩形，并將每個矩形劃分為“癌”、“非癌”。以30例胃癌、30例正常對照作為訓練組，以其差異蛋白質(zhì)波峰強度

10、為基礎進行學習訓練，確定判斷癌與非癌的蛋白質(zhì)豐度閾值(界值)。按照49個差異蛋白質(zhì)在訓練組中癌與非癌鑒別過程中的權重打分并排序，按權重排序原則首先選用單一蛋白質(zhì)，然后再試用多個蛋白質(zhì)相互組合進行樹狀分類器模型構建。通過學習和自我訓練，以能達到對訓練組標本最佳分類的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組合作為初步構建的早期胃癌預警樹狀分類器模型。 2.采用盲篩實驗評估早期胃癌預警決策樹分類器模型 2.1 參與盲篩實驗的病例資料：本組病例中未參加

11、建模的27例胃癌患者、7例良性患者及19例健康對照。 2.2盲篩實驗方法：采用蛋白質(zhì)芯片質(zhì)譜分析儀配置的Biomarker Patterns軟件初步建立早期胃癌預警決策樹分類器模型。分別用上述建立的樹狀分類模型對盲篩組標本蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)做出相應的“癌”與“非癌”的判定，判定結果與標本實際病理診斷相符為判別正確，否則為錯誤。 2.3 對初步建立的早期胃癌預警決策樹分類器模型進行評估：根據(jù)盲篩實驗結果，采用敏感性、特異性

12、、陽性預測值、陰性預測值、總有效率等指標對模型分類效果進行評估。 結果: 1.健康者、胃良性病變及早期胃癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜變化胃良性病變與健康者相比較其差異蛋白質(zhì)達26種之多，但與早期胃癌患者間的差異蛋白質(zhì)僅6種，早期胃癌與健康對照差異蛋白質(zhì)數(shù)量達42種，其中27種蛋白質(zhì)在早期胃癌中低表達，15種在早期胃癌中高表達。 2.不同分化程度胃癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜變化發(fā)現(xiàn)高、低分化胃癌血清蛋白質(zhì)譜有不同特征，其

13、中M/Z為2091、2197、2281等蛋白在低分化胃癌組呈高表達，而M/z為34927蛋白在高分化胃癌組呈高表達。 3.不同臨床病理分期胃癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜變化進展期與早期胃癌組之間檢出19種顯著差異表達蛋白質(zhì)；伴臟器轉移組與導期胃癌組之間檢出13種顯著差異表達蛋白質(zhì)；進展期胃癌中，伴臟器轉移組與不伴臟器轉移組之間檢出7種顯著差異表達蛋白質(zhì)。 4.胃癌肝轉移與其它消化道癌肝轉移蛋白質(zhì)指紋圖譜變化在9例胃癌肝轉移與

14、9例其它消化道癌肝轉移患者的血清差異蛋白質(zhì)指紋圖譜比對分析中，共獲得16種差異蛋白質(zhì)峰譜，其中9種差異蛋白質(zhì)在胃癌肝轉移組顯著高于其它消化道癌肝轉移組，更有意義的是，與非胃消化道癌肝轉移組相比，胃癌肝轉移組顯著差異表達的4887、6196、10260、9288 M/Z四種蛋白質(zhì)與正常對照組比較也有顯著性差異。 5.早期胃癌決策樹分類器模型構建與盲篩驗證本實驗共建立3個早期胃癌決策樹分類器模型。 摸型I由6196 M/Z單

15、一蛋白質(zhì)構成，用模型Ⅰ對未參加建模的27例胃診斷正確率為42.9％(3/7)，有4例被誤判為胃癌。 模型Ⅱ主要由6366 M/Z蛋白質(zhì)構成，用模型Ⅱ?qū)ξ磪⒓咏５?7例胃癌、7例胃良性病患者及19例健康者進行識別試驗(盲篩)，結果27例胃癌診斷正確率為96.3％(26/27)，僅有Ⅰ例被誤判為非癌；19例健康者診斷正確率為100％(19/19)；7例胃良性病變診斷正確率為42.9％(3/7)，有4例被誤判為胃癌。 模型Ⅲ

16、主要由M/Z為13738，8931，2048三種差異蛋白質(zhì)構成。用模型Ⅲ對盲篩組患者盲篩，結果27例胃癌診斷正確率為96.3％(26/27)，僅有1例被誤判為非癌；19例健康者診斷正確率為94.7％(18/19)，有1例被誤判為胃癌；7例胃良性病變診斷正確率為14.3％(1/7)，有6例被篩為胃癌。 結論： 1.與健康對照組相比較，早期胃癌組血清蛋白質(zhì)指紋圖譜有顯著差異，提示血清蛋白質(zhì)指紋圖譜對早期胃癌預警可能有潛在的應

17、用前景。本研究初步篩出6366、6196M/Z等幾種在早期胃癌患者血清中低表達的蛋白質(zhì)，目前尚未見文獻報道，有可能成為新的早期胃癌預警分子。 2.不同分化程度的胃癌具有不同的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，其中低分化胃癌組血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與其它分化程度胃癌組相比差異顯著，提示低分化胃癌涉及的基因及蛋白表達異?？赡芨鼮閺碗s。 3.本實驗共獲得16種胃癌肝轉移與其它消化道癌肝轉移血清差異蛋白，其中6196、4887、10260、928