食管癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜建立及臨床早期診斷.pdf

1、研究背景及目的:食管癌(carcinomaofesophagus)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其診斷對于具有典型臨床表現(xiàn)者并不困難，但這時患者往往已界中晚期，預(yù)后不佳。因此食管癌的早期診斷和治療一直為科研和臨床工作者所關(guān)注，而尋找具有高靈敏度和高特異性的食管癌特異性標(biāo)志物則是食管癌早期診斷的關(guān)鍵所在。 食管癌是一種多基因、多步驟的，具有復(fù)雜性狀的疾病，是包含了多個基因突變分子事件的過程，如抑癌基因的功能喪失，癌基因的活化等。因此

2、用單個因子的檢測對食管癌進(jìn)行早期診斷和預(yù)后的估計(jì)，以及隨訪監(jiān)測必定不可避免地存在敏感性和特異性的矛盾。近年來，隨著多腫瘤標(biāo)志物生物芯片在臨床中的應(yīng)用，腫瘤的早期診斷準(zhǔn)確率有所提高，但由于多腫瘤標(biāo)志物生物芯片作為臨床腫瘤的廣譜篩選手段，對單一腫瘤的特異性不高，且多腫瘤標(biāo)志物的檢測局限于分子量較大的蛋白質(zhì)，而血清蛋白組中低分子量(＜15ku)蛋白也可能包含有大量生物標(biāo)記物。此外，在疾病發(fā)展過程中一系列酶解或蛋白水解過程產(chǎn)生了大量蛋白片段，其

3、中大部分通過腎臟排除，血液中所攜帶的血清標(biāo)記物濃度很低，常規(guī)蛋白檢測技術(shù)很難發(fā)現(xiàn)。以上缺陷大大限制了多腫瘤標(biāo)志物生物芯片在臨床的應(yīng)用。 九十年代初表面加強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(surface-enhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，SELDI-TOF-MS)技術(shù)的出現(xiàn)為臨床蛋白組學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的工具，可以克服以往蛋白檢測技術(shù)所固有

4、的缺陷。蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)(Proteinchiparraysystem)利用SELDI-TOF-MS將蛋白質(zhì)保留在固相層析表面，經(jīng)離子化后用TOF-MS檢測。利用這種技術(shù)可對血清、尿液、細(xì)胞裂解液等生物樣品直接進(jìn)行檢測，且具有高靈敏度及高通量性的特點(diǎn)，能反映被檢樣本中蛋白質(zhì)的全貌，進(jìn)而同時找到多個蛋白質(zhì)標(biāo)志物，為早期診斷、預(yù)后估計(jì)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的監(jiān)測提供了可能。 本研究旨在利用Ciphergen公司的蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜儀系統(tǒng)，選

5、擇金屬螯和芯片，對食管癌患者(包括手術(shù)前后)、食管良性疾病患者及正常人血清的比較蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，以期發(fā)現(xiàn)可用于食管癌早期診斷、預(yù)后估計(jì)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移監(jiān)測的相對特異性蛋白質(zhì)，為尋找食管癌標(biāo)志物提供新的研究思路。 實(shí)驗(yàn)方法采用美國Ciphergen公司的IMAC3芯片和表面增強(qiáng)激光電離及解析飛行時間質(zhì)譜儀，檢測132份血清標(biāo)本中的蛋白質(zhì)相對含量，其中包括44例食管癌術(shù)前患者，22例食管癌術(shù)后患者(術(shù)后1周)，24例食管良性疾病患者

6、和42例正常人的血清，得到各組蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖。進(jìn)一步采用CiphergenBiosystems軟件進(jìn)行波譜分析，從而得到能夠正確分組的特異性蛋白標(biāo)志物并構(gòu)建食管癌診斷模型。采用多腫瘤標(biāo)志物生物芯片檢測食管癌術(shù)前患者血清標(biāo)本，與SELDI-TOF-MS技術(shù)構(gòu)建的食管癌診斷模型進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用IMAC3蛋白芯片和SELDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)對44例食管癌術(shù)前患者、42例正常人血清蛋白進(jìn)行分析，獲得的質(zhì)譜圖用Cipherge

7、n公司的BiomarkerWizard和BiomarkerPattern軟件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有36個蛋白質(zhì)表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，并獲得質(zhì)荷比為9479.43Da這一個蛋白質(zhì)建立的模板，可將食管癌患者與正常人正確分組，其敏感性和特異性分別為95.4％(42/44)、95.2％(40/42)。22例術(shù)后患者血清蛋白譜中，術(shù)前高表達(dá)蛋白質(zhì)中有6種在術(shù)后表達(dá)明顯下降，而術(shù)前低表達(dá)的蛋白質(zhì)中有1種在術(shù)后表達(dá)明顯上升。進(jìn)一步用IMA

8、C3蛋白芯片和SELDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)對44例食管癌術(shù)前患者及24例食管良性疾病患者的血清進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩組血清蛋白在質(zhì)荷比為9284.74Da及3921.31Da處含量有顯著差異(P＜0.05)。用這兩種蛋白質(zhì)構(gòu)建的樹狀分類模型對兩組患者進(jìn)行診斷，其敏感性和特異性分別為97.7％(43/44)、100％(24/24)。而多腫瘤標(biāo)志物生物芯片聯(lián)合檢測的結(jié)果顯示，44例食管癌術(shù)前患者血清中僅有10例診斷為陽性，診斷敏感性僅為2