系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨髓造血微環(huán)境研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是臨床常見的一種自身免疫性疾病，雖然激素和細胞毒藥物顯著改善了其預(yù)后，但仍有部分病人激素依賴或無效，而且難于根治。其發(fā)病原因至今尚未明了，一般認為引起其免疫障礙的因素是多方面的，T淋巴細胞的病態(tài)活化和B淋巴細胞內(nèi)源性過度激活及其所產(chǎn)生的致病性自身抗體在SLE發(fā)病中起重要作用，而免疫系統(tǒng)中所有的細胞都來自造血干細胞，根據(jù)動物實驗和早期的臨床實踐，有人提出“自身免疫病-干細胞疾病”的觀點。 造血微環(huán)境由20世

2、紀70年代Trentin首先提出，1977年Dexter建立了長期骨髓細胞培養(yǎng)方法，使在體外研究造血微環(huán)境成為可能，造血微環(huán)境與造血干細胞的關(guān)系被喻為“土壤與種子”關(guān)系。骨髓造血微環(huán)境由骨髓基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)、粘附分子、基質(zhì)細胞分泌的各種細胞因子及血管神經(jīng)等組成，通過與造血細胞密切接觸、分泌細胞外基質(zhì)和多種細胞因子調(diào)節(jié)造血，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于保持機體在生理狀況尤其是應(yīng)激狀態(tài)時造血的穩(wěn)定性具有十分重要的作用。 骨髓基質(zhì)細胞

3、分泌細胞因子除參與造血外也可參與免疫炎性反應(yīng)，對免疫活性淋巴細胞的前體細胞起重要的作用。引起SLE患者干／祖細胞異常的機制并不明確，干細胞的異常是原發(fā)于基因異常，還是與其他因素如骨髓基質(zhì)細胞功能異常有關(guān)仍不清楚，以前對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究多集中在造血干細胞的生物學(xué)特性，而對骨髓造血微環(huán)境的研究較少，Otsuka報道8例SLE患者骨髓基質(zhì)細胞集落與正常人無異，Papadaki等比較7例SLE患者與28例正常人，發(fā)現(xiàn)SLE患者的骨髓基質(zhì)細胞

4、不能支持異體同源的正常造血干細胞，Taketoshi等發(fā)現(xiàn)將C57BL／6小鼠的骨髓(包括骨髓基質(zhì)細胞)經(jīng)門靜脈移植于MRL／lpr小鼠，效果明顯優(yōu)于僅造血干細胞移植組。另外細胞因子的異常分泌對骨髓中T淋巴細胞的存活、激活及自身抗體的分泌可能產(chǎn)生作用。以上研究表明SLE不僅僅是造血干細胞損傷所致，骨髓造血微環(huán)境結(jié)構(gòu)及功能的改變也起一定程度作用，骨髓基質(zhì)細胞從多個方面影響系統(tǒng)性紅斑狼瘡造血干細胞的生物學(xué)特性，參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病及病

5、理過程。 本研究分四部分，首先采用體外集落培養(yǎng)方法，觀察30例SLE患者骨髓基質(zhì)細胞集落形成單位數(shù)為71.1±20.3／2×10<'6>MNC，15例正常骨髓為70.9±21.3／2×10<'6>MNC，而SLE活動組(n=18)、非活動組(n=12)分別為67.2±17.5、77.0±23.4／2×10<'6>MNC，各組間比較無顯著性差異(P>0.05)，從形態(tài)學(xué)觀察各組也無明顯差別，在我們的研究中，30例SLE患者骨髓涂片

6、檢查均增生活躍或明顯活躍，不排除骨髓低下患者可能出現(xiàn)骨髓基質(zhì)細胞數(shù)量減少的情況；免疫組化測定細胞基質(zhì)如纖維粘連蛋白(Fn)、層粘連蛋白(Ln)、Ⅳ型膠原的表達情況，三者經(jīng)全自動圖像分析發(fā)現(xiàn)SLE患者與正常對照組基本相同(P>0.05)。表明SLE患者骨髓造血微環(huán)境支架結(jié)構(gòu)正常，假如SLE存在骨髓造血微環(huán)境缺陷，或因此而影響造血干細胞的生物學(xué)特性，與髓基質(zhì)細胞數(shù)量改變或細胞基質(zhì)的關(guān)系不大，可能與其他的途徑或環(huán)節(jié)有關(guān)。 繼而，我們用

7、流式細胞儀測定SLE患者骨髓基質(zhì)細胞表面細胞間粘附分子(ICAM-1，CD54)、血管細胞粘附分子(VCAM-1，CD106)的表達為56.4±14.8％和55.6±12.2％，均明顯高于對照組(41.6±12.4％和40.5±11.7％，P<0.01)，雖然SLE活動組與非活動組之間差別不大(P>0.05)，但兩者均與SLEDAI評分相關(guān)，分別r=0.672，P<0.01：r=0.384，P<0.05。提示SLE患者骨髓基質(zhì)細胞ICA

8、M-1、VCAM-1可以作為疾病活動的指標之一，骨髓微環(huán)境存在異常的免疫反應(yīng)，基質(zhì)細胞與造血干細胞間的粘附性能增加，骨髓基質(zhì)細胞與造血干細胞間相互作用進一步加強，造血細胞與基質(zhì)細胞粘附影響細胞因子的分泌，細胞因子反過來也影響造血細胞與基質(zhì)細胞粘附，兩者之間是互相影響，共同調(diào)節(jié)造血。 我們再用雙抗體夾心ELISA方法檢測基質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液中白介素-6(IL-6)、干細胞因子(SCF)、基質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1)等正調(diào)控因子的濃

9、度，SLE患者除IL-6高于對照組外(297.1±51.9 Vs 139.9±58.9 pg/ml，P<0.01)，SCF、SDF-1與正常人無異(19.4±7.1Vs 18.1±6.9、50.0±13.9 Vs 47.5±15.2 pg/ml，P>0.05)，而三者在SLE活動組與非活動組則基本相近(P>0.05)，考慮除原發(fā)骨髓造血微環(huán)境缺陷所致外，亦與SLE自身抗體破壞外周血細胞后反應(yīng)性骨髓代償增生，部分正調(diào)控因子表達增高有關(guān)。另

10、外，進一步檢測一組原發(fā)性血小板減少性紫癜或溶血性貧血患者(n=15)，SCF高于正常人、SLE組及SLE活動組(25.8±9.6pg/ml，P<0.05)，證實上述觀點。半定量RT-PCR檢測骨髓基質(zhì)細胞上述細胞因子m-RNA，結(jié)果亦相同。 骨髓造血微環(huán)境中的細胞因子是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，種類繁多，一種細胞因子的改變，不僅對造血干細胞有影響，而且作用于骨髓基質(zhì)細胞，還可以誘發(fā)其它的細胞因子發(fā)生變化。所以，SLE患者骨髓基質(zhì)細胞分

11、泌的多種細胞因子發(fā)生改變，對造血及自身免疫造成的影響，不是簡單的算術(shù)加減，而是綜合的作用。 骨髓基質(zhì)細胞分泌細胞因子除參與造血外也可參與免疫炎性反應(yīng)，對免疫活性淋巴細胞的前體細胞起重要的作用，本研究采用MTT法檢測SLE患者骨髓基質(zhì)細胞及其培養(yǎng)上清液對淋巴細胞增殖的影響，以及IL-6、MIP-1、IFN-γ、TGF-β在其中所起的作用。在Con A存在的情況下，外周血淋巴細胞發(fā)生顯著的增殖效應(yīng)。但無論正常人骨髓基質(zhì)細胞上清液(0

12、.357±0.114 Vs 0.611±0.110)，還是SLE患者骨髓基質(zhì)細胞上清液(0.457±0.112 Vs 0.611±0.110)，均對Con A誘導(dǎo)的外周血淋巴細胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.01)；而SLE患者的抑制作用也明顯低于正常人(P<0.01)；而活動期SLE患者的抑制作用低于非活動期患者，但無統(tǒng)計學(xué)差異(0.484±0.114 Vs 0.418±0.094，P>0.05)。無論正常人骨髓基質(zhì)細胞上清液，還是S

13、LE患者骨髓基質(zhì)細胞上清液，在分別加入抗MIP-1(0.276±0.09lVs 0.357±0.114，0.354±0.092 Vs 0.457±0.112)、抗IFN γ單抗(0.237±0.06391 Vs0.357±0.114，0.361±0.083 Vs 0.457±0.112)后，骨髓基質(zhì)細胞上清液對外周血淋巴細胞增殖的抑制作用明顯增強(P<0.01)，加入抗IL-6則無差別不大(0.322±0.097 Vs 0.357±0.

14、114，0.430±0.113 Vs 0.457±0.112，P>0.05)；而加入抗TGF B單抗后(0.457±0.105 Vs 0.357±0.114，0.558±0.143 Vs 0.457±0.112，P<0.01)，骨髓基質(zhì)細胞上清液對外周血淋巴細胞增殖的抑制作用明顯減弱，說明這些因子參與了對外周血淋巴細胞增殖的影響，而SLE患者抑制作用的減弱可能與MIP-1、IFNγ升高以及TGFβ降低有關(guān)。 本研究結(jié)果說明，SL

15、E患者骨髓造血微環(huán)境存在缺陷，主要表現(xiàn)為骨髓基質(zhì)細胞表面粘附分子表達升高，細胞因子分泌異常，MIP-l、IFN-γ增加，而TGF-β下降，骨髓基質(zhì)細胞對造血干細胞的支持能力下降，骨髓基質(zhì)細胞對淋巴細胞的抑制作用減低。SLE患者骨髓基質(zhì)細胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1以及細胞因子MIP-1、IFN-γ、TGF-β的表達可以作為疾病活動指標之一，骨髓基質(zhì)細胞參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展，針對骨髓基質(zhì)細胞的靶向治療將可能有利于疾病的恢復(fù)，如強

16、化免疫治療、基因治療以及骨髓基質(zhì)細胞聯(lián)合造血干細胞移植等。 小結(jié)： 1．SLE患者骨髓造血微環(huán)境中基質(zhì)細胞及其分泌的細胞基質(zhì)基本正常，說明 其支架結(jié)構(gòu)正常；SLE患者骨髓基質(zhì)細胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1表達增高；骨髓基質(zhì)細胞正調(diào)控細胞因子IL-6表達增高，可能與原發(fā)骨髓造血微環(huán)境缺陷有關(guān)，也可能繼發(fā)于外周血破壞骨髓代償增生；負調(diào)控細胞因子MIP-1、IFN-γ表達增高，TGF-β表達降低，且SL

17、E活動者改變更為顯著。骨髓基質(zhì)細胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1以及細胞因子MIP-1、IFN-γ、TGF-β的表達可以作為疾病活動指標之一。 2．SLE患者骨髓基質(zhì)細胞對造血干細胞的支持能力較正常人差，這可能SLE患者骨髓基質(zhì)細胞負調(diào)控因子分泌增多有關(guān) 3．骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液，或骨髓基質(zhì)細胞均對ConA誘導(dǎo)的外周血淋巴細胞增殖有抑制作用，但培養(yǎng)上清液的抑制作用更為明顯；SLE患者骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液對外周血淋