熒光定量PCR溶解曲線法初步分析大腸癌患者TCRβ鏈CDR3譜系漂移.pdf

1、目的：建立熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase ChainReaction FQ-PCR)溶解曲線分析技術(shù)，初步對(duì)正常人外周血及大腸癌患者外周血、癌周組織中T細(xì)胞抗原受體(T Cell Receptor，TCR)β鏈各家族互補(bǔ)決定區(qū)3(Complementarity Determining Region3，CDR3)譜系進(jìn)行熒光PCR定量分析，并采用溶解曲線法分析TCRβ鏈各家族的單克

2、隆、寡克隆、多克隆增生(CDR3譜系漂移)情況。下一步擬對(duì)單克隆或寡克隆增生的T淋巴細(xì)胞β鏈的CDR3區(qū)進(jìn)行測(cè)序，分析大腸癌患者機(jī)體抗腫瘤T細(xì)胞的TCR分子特征，為大腸癌患者T細(xì)胞應(yīng)答機(jī)制、個(gè)性化治療提供理論基礎(chǔ)。 方法：1、標(biāo)本采集：(1)采集4例正常人外周抗凝靜脈血5ml；(2)采集9例大腸癌患者術(shù)前外周靜脈血5ml及其中7例手術(shù)患者癌周?chē)M織(30 μg以上)；2、按密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral

3、 Blood Mononuclear Cell，PBMC)，提取PBMC及組織樣品中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：3、以各研究對(duì)象的cDNA為樣本，以人TRBV26個(gè)家族基因設(shè)計(jì)上游引物，TRBC基因設(shè)計(jì)共同的下游引物，熒光定量PCR擴(kuò)增TCRβ鏈各家族的CDR3區(qū)，進(jìn)行相對(duì)定量分析，同時(shí)對(duì)各PCR產(chǎn)物做溶解曲線圖，分析各家族CDR3譜型。 結(jié)論：(1)正常人PBMC中26個(gè)TRBV CDR3的熒光定量PCR溶解曲線譜型圖呈多峰圖

4、，無(wú)單峰、寡峰、偏峰及極低水平或缺失等現(xiàn)象出現(xiàn)，提示機(jī)體在沒(méi)有腫瘤、感染、自身免疫疾病的情況下，TCR B鏈CDR3譜型圖呈高斯分布；(2)在大腸癌患者PBMC及其組織樣本中腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞(Tumour Infiltrating Lymphocyte，TIL)的TRBV CDR3熒光定量PCR溶解曲線譜型圖中，顯示TCRβ鏈各家族出現(xiàn)數(shù)目不等的單峰、寡峰、偏峰及極低水平或缺失等現(xiàn)象，提示其可能是在腫瘤相關(guān)抗原等決定簇的驅(qū)使下而發(fā)生