HFRS疫苗志愿接種者PBL中CD4+T、CD8+T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3譜系的監(jiān)測及CDR3分子特征初步分析.pdf

1、目的：
　　(1)探討腎綜合征出血熱（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）疫苗志愿接種者，在疫苗接種前和接種后外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocytes，PBL)中，CD4+T、CD8+T細(xì)胞TCRβ鏈各家族互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determiningregion，CDR)3譜系漂移和CDR3的分子特征;
　　(2)初步分析

2、HFRS疫苗志愿接種者接種后CD4+T、CD8+T TCRβ鏈各家族CDR3譜系漂移和人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antiger，HLA)的相關(guān)性;
　　(3)選取部分疫苗志愿接種者接種疫苗后，呈顯著變化的TRBV(TCRβ chain variablegene，TRBV)優(yōu)勢利用家族CDR3進(jìn)行克隆測序，生物信息學(xué)分析CDR3區(qū)的基因、氨基酸組成和特征。
　　方法：
　　(1)在遵醫(yī)2008級研究

3、生中篩選出10例漢坦病毒(hantavirus.HV)抗體陰性HFRS疫苗志愿接種者，按HFRS疫苗接種程序和要求，完成HFRS疫苗的三次接種，并于接種前0天、接種1個月后、接種6個月后采集外周血樣本（15ml/次）;免疫磁珠法(MagneticActivated Cell Sorting，MACS)分選PBL中的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分選純度;
　　(2)設(shè)計并合成人T細(xì)胞26個TRBV家族上游引物、1個

4、TRBC(TCRβ chain constantgene，TRBC)下游引物;以10例漢坦病毒(hantavirus，HV)抗體陰性的HFRS疫苗志愿接種者接種前、后的外周血PBL中的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞為研究樣本，;提取各樣本CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用各TRBV家族特異性引物，熒光定量PCR(FQ-PCR)擴(kuò)增26個TRBV家族包含完整CDR3區(qū)段的cDNA; FQ-PCR熔解曲線法分

5、析HFRS疫苗志愿接種者接種前、后CD4+T、CD8+T細(xì)胞TCRβ鏈的26個TRBV家族CDR3譜系漂移的特征;
　　(3)提取10例HFRS疫苗志愿接種者基因組DNA，采用PCR-SBT(Sequencing basedtyping，SBT)法測序HLA-A、HLA-DR、HLA-DQ等位基因序列，初步分析疫苗接種前后TRBV家族CDR3譜系漂移和HLA的關(guān)系;
　　(4)選取部分疫苗志愿接種者接種疫苗后，呈顯著變化的T

6、RBV家族CDR3，進(jìn)行普通PCR; PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行克隆測序，生物信息學(xué)分析其CDR3區(qū)基因序列、氨基酸序列的組成和特征。
　　結(jié)果：
　　(1)10例HFRS疫苗志愿接種者，在接種后CD4+T、CD8+T細(xì)胞的26個TRBV家族CDR3的熔解曲線譜系圖中，多數(shù)家族和接種前比較無變化，但每個志愿者均出現(xiàn)一個或幾個TRBV家族CDR3的優(yōu)勢利用;
　　(2)10例HFRS疫苗志愿接種者接種前和接種后CD4+T和CD

7、8+T細(xì)胞出現(xiàn)的優(yōu)勢利用TRBV家族并不相同，不同志愿接種者之間存在共同優(yōu)勢利用的家族;
　　(3)在CD8+T細(xì)胞研究中，對兩例HLA-A分子相同的志愿接種者(NO.6、NO.10)的優(yōu)勢利用家族(TRBV6、11;TRBV5.1、13.1)測序發(fā)現(xiàn):兩例HLA-A分子相同的個體的優(yōu)勢利用家族并不是同一種CDR3序列的T細(xì)胞克隆增殖，但是CDR3氨基酸序列分析，二者之間存在一些共同的基序（如: GYT、EQY、NEQF、GG、T

8、EAF、 GELF等）。
　　結(jié)論：
　　(1) HFRS疫苗志愿接種者接種前和接種后TCR CDR3譜系的變化，提示HFRS疫苗接種誘導(dǎo)了機(jī)體相應(yīng)的T細(xì)胞應(yīng)答;
　　(2) CD4T和CD8+T細(xì)胞出現(xiàn)的優(yōu)勢利用TRBV家族CDR3的多樣性，提示:HV抗原的多樣性和個體之間不同的HLA分子造成了機(jī)體T細(xì)胞應(yīng)答的多樣化，同時T細(xì)胞對HFRS疫苗的應(yīng)答和HLA表現(xiàn)一定的相關(guān)性;
　　(3)兩例HLA-A分子相同的志