釉質上皮型顱咽管瘤實驗模型建立及IL-6對釉質上皮型顱咽管瘤細胞體外遷移特性的影響.pdf

1、顱咽管瘤(Craniopharyngioma，CP)是一種沿顱咽管路徑生長的顱內上皮來源的軸外腫瘤，多位于鞍區(qū)或鞍旁區(qū)域，是顱內最常見的先天性腫瘤之一。顱咽管瘤約占所有兒童顱內腫瘤發(fā)病率的6-13％，特別是在鞍區(qū)兒童腫瘤中占60％以上。1904年，奧地利神經病理學家Jakob Erdheim首次將顱咽管瘤作為一類單獨存在的鞍區(qū)腫瘤進行了詳細的描述，100多年過去了，國內外廣大學者對顱咽管瘤進行了廣泛而深入的研究，但限于該腫瘤研究平臺的缺

2、乏和技術條件的制約，目前對于其腫瘤起源、病理特征、腫瘤生物學特性等方面的認識仍有很大爭議。
　　 顱咽管瘤屬于良性腫瘤，國際衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)腫瘤病理分類為Ⅰ級，按組織形態(tài)可分為釉質上皮型(Adamantinomatous craniopharyngioma，ACP)和鱗狀乳頭型(Squamous papillary craniopharyngioma，SPCP)兩個亞型。相較

3、于后者，釉質上皮型顱咽管瘤常形成指狀突起侵襲周圍腦組織，術中全切腫瘤困難，術后易復發(fā)，臨床預后也差于后者。國外多個單中心大宗隨訪結果也提示釉質上皮型顱咽管瘤患者預后較鱗狀乳頭型差，但具體機制尚不清楚。多年來，由于缺乏穩(wěn)定的體外及體內模型，國內外學者主要在組織學層面對釉質上皮型顱咽管瘤進行了大量研究，但相關基礎研究進展緩慢;少數學者對釉質上皮型顱咽管瘤細胞進行了體外培養(yǎng)并應用于功能實驗，但文中均未對腫瘤細胞特性進行相關描述，體內移植瘤模型

4、也少有報道。我們有必要對釉質上皮型顱咽管瘤實驗模型進一步探索，為深入了解該腫瘤生物學特性和發(fā)生發(fā)展規(guī)律提供新的研究手段。
　　 我課題組前期研究中發(fā)現:顱咽管瘤，特別是釉質上皮型顱咽管瘤與周邊正常神經組織常形成炎癥粘連，導致術中難以全切腫瘤，術后腫瘤易復發(fā)，炎癥程度與患者預后明顯相關;自發(fā)的顱咽管瘤囊性結構破裂和術中囊液滲漏?？蓪е聼o菌性腦膜炎的發(fā)生;組織學檢查發(fā)現釉質上皮型顱咽管瘤細胞周圍常形成密實的膠質增生帶和大量炎癥細胞侵

5、潤。這些現象說明顱咽管瘤細胞或腫瘤間質細胞可能通過產生大量炎癥細胞因子調節(jié)腫瘤炎癥的發(fā)生發(fā)展，影響患者預后。Mori曾報道白細胞介素6(Inierleukin-6，IL6)在顱咽管瘤中異常表達，可能是導致顱咽管瘤炎癥的重要炎性介質，影響患者預后;但限于缺乏可靠的實驗手段，作者并未繼續(xù)在體外或體內進行相關功能實驗深入研究，其具體作用機制尚不清楚。
　　 IL6是一種重要的多功能細胞因子，參與調節(jié)造血、免疫與炎癥反應，與細胞凋亡、增

6、殖、損傷修復等密切相關，也參與調節(jié)中樞神經和心血管系統(tǒng)的重要生理功能。同時，IL6在大腸癌、乳腺癌等多種上皮性腫瘤以及腦膠質瘤等中樞神經腫瘤中均有高表達，且與腫瘤預后密切相關。IL6可以通過腫瘤細胞“自分泌”或腫瘤微環(huán)境中間質細胞“旁分泌”等途徑，與相應受體結合形成復合體導致異常信號通路的激活，進而促進腫瘤發(fā)生、腫瘤新生血管形成，腫瘤遷移侵襲能力提高。然而，IL6在釉質上皮型顱咽管瘤中的具體作用尚不清楚。由此，我們假設:釉質上皮型顱咽管

7、瘤細胞及其微環(huán)境中間質成分是否也能通過“自分泌”或“旁分泌”的方式分泌IL6，促使腫瘤細胞特性發(fā)生改變，從而影響患者預后？
　　 因此，基于釉質上皮型顱咽管瘤基礎研究的需要以及IL6在該腫瘤中可能存在的重要生物學作用，本研究采用原代培養(yǎng)的方法建立人釉質上皮型顱咽管瘤有限細胞系，明確其生物學性狀;采用裸小鼠皮下種植細胞懸液的方法探討釉質上皮型顱咽管瘤體內模型建立的可能性;同時，采用抗體芯片技術檢測不同炎癥分級腫瘤組織中炎癥細胞因子

8、的表達，外源性IL6刺激釉質上皮型顱咽管瘤細胞，明確IL6對腫瘤細胞生物學特性的作用，并對其相關作用機制進行初步分析，旨在闡述炎癥與顱咽管瘤間的相互關系，為臨床治療顱咽管瘤提供新的思路。
　　 第一章第一節(jié)釉質上皮型顱咽管瘤細胞模型的建立與檢測
　　 目的:探討有效的釉質上皮型顱咽管瘤細胞原代培養(yǎng)方法，檢測體外培養(yǎng)的腫瘤細胞自身生物學特性。
　　 方法:采用胰酶消化法建立釉質上皮型顱咽管瘤有限細胞系，并通過濾膜分

9、次過濾法純化細胞;倒置顯微鏡、HE染色觀察生長情況及細胞形態(tài)，免疫細胞化學方法鑒定腫瘤表型，噻唑藍比色法繪制細胞生長曲線，并用流式細胞技術分析腫瘤細胞周期。
　　 結果:本次原代培養(yǎng)成功率為88.9％，其中原代細胞可傳代率為81.3％。人釉質上皮型顱咽管瘤細胞在含血清培養(yǎng)基中呈貼壁生長，腫瘤細胞常成小團狀生長，體積大，胞漿豐富，可見少量氣泡狀結構，細胞呈不規(guī)則多邊形“上皮樣”形態(tài)，胞核成圓形，體移較大。免疫細胞化學鑒定Pan-c

10、k在釉質上皮型顱咽管瘤細胞胞漿內表達，證實其上皮性來源。腫瘤細胞體外增殖緩慢，但第1-5天細胞增殖率均有差異(F=190.748，P＜0.0001)，細胞周期顯示腫瘤細胞均在正常二倍體范圍內，未見異倍體細胞出現，腫瘤細胞多處于G0-G1期，46.8±3.61％;部分處于G2-M期，37.3±1.51％;少部分處于S期，15.9±2.77％。
　　 結論:采用有血清貼壁培養(yǎng)法可以建立釉質上皮型顱咽管瘤有限細胞系模型。通過濾膜分次過

11、濾等特殊處理方法，可有效地對釉質上皮型顱咽管瘤進行分離、培養(yǎng)和擴增，有利于后續(xù)實驗的進行,釉質上皮型顱咽管瘤細胞呈現Pan-CK陽性表型，細胞主要處于G0-G1期，體外增殖緩慢，倍體分析未見異倍體細胞。
　　 第一章第二節(jié)人釉質上皮型顱咽管瘤裸鼠皮下移植瘤模型的初步建立
　　 目的:在前期釉質上皮型顱咽管瘤有限細胞系建立的基礎上，初步建立人釉質上皮型顱咽管瘤的裸鼠皮下移植瘤模型。
　　 方法:采用胰酶消化法將新鮮

12、的釉質上皮型顱咽管瘤組織原代培養(yǎng)，常規(guī)傳代，然后將純化的第三代顱咽管瘤細胞制成細胞懸液，接種到BALB/c裸小鼠背部皮下或腋下，觀察接種成瘤后腫瘤組織生長情況和特點，明確腫瘤基本性質。
　　 結果:利用體外培養(yǎng)的釉質上皮型顱咽管瘤細胞種植于裸小鼠皮下可以建立該腫瘤移植瘤模型。顱咽管瘤細胞可以在裸鼠皮下存活，接種后8天可見有移植瘤形成，背部成瘤率約為37.5％，病理切片顯示腫瘤樣鱗狀上皮細胞團增生。
　　 結論:通過顱咽管

13、瘤細胞原代培養(yǎng)，裸鼠皮下種植已純化的腫瘤細胞懸液可以建立顱咽管瘤移植瘤動物模型，有可能作為顱咽管瘤基礎研究的有效手段。但目前該模型尚不穩(wěn)定，成瘤率較低，需要更多的研究優(yōu)化該移植瘤建立的條件。
　　 第二章第一節(jié)顱咽管瘤上皮間質轉化相關蛋白的表達及臨床病理聯(lián)系
　　 目的:檢測顱咽管瘤，特別是腫瘤正常組織交界處上皮間質轉化相關蛋白( Vimentin，E-cadherin，β-catenin)表達，聯(lián)系臨床病理和預后進行相

14、關分析。
　　 方法:運用免疫組化和免疫熒光方法檢測42例顱咽管瘤中Vimentin，E-cadherin，β-catenin的表達，聯(lián)系臨床病理特征和預后進行相關分析。
　　 結果:腫瘤整體和腫瘤正常組織交界處，釉質上皮型和鱗狀乳頭型顱咽管瘤兩亞型間Vimentin，E-cadherin表達均有顯著差別(x2=11.181，P=0.004，x2=6.931，P=0.031;x2=17.393，P＜0.001，x2=8.

15、501，P=0.014);腫瘤正常組織交界處，β-catenin核/漿表達在兩亞型腫瘤中有顯著差別(x2=19.765，P＜0.001)。整體范圍內，Vimentin和E-cadherin表達與腫瘤復發(fā)、術后體重和下丘腦功能紊亂相關(x2=23.834，P＜0.001，r=0.643,P＜0.001，r=0.637,P＜0.001;x2=16.526,P＜0.001，r=-0.579,P＜0.001,r=-0.714，P＜0.001);

16、腫瘤正常組織交界處，Vimentin和E-cadherin/β-catenin表達與腫瘤復發(fā)、術后體重和下丘腦功能紊亂相關(x2=19.782，P＜0.001，r=0.642，P＜0.001，r=0.573,P=0.001;x2=11.475,P=0.003，r=-0.54,P＜0.001，r=-0.626,P＜0.001; x2=16.572,P＜0.001，r=-0.54,P＜0.001,r=-0.506,P=0.001)。

17、　　 結論:本研究首次證實顱咽管瘤組織中Vimentin，E-cadherin和β-catenin表達與腫瘤預后相關;上皮間質轉化有可能是影響顱咽管瘤進程的重要機制之一。
　　 第二章第二節(jié)IL-6對釉質上皮型顱咽管瘤細胞體外遷移特性的影響
　　 目的:探討IL6對釉質上皮型顱咽管瘤細胞遷移特性的影響及其相關作用機制。
　　 方法:回顧性分析炎癥等級與顱咽管瘤臨床病理特點的相關性;采用抗體芯片檢測不同炎癥等級的

18、釉質上皮型顱咽管瘤組織的差異炎癥細胞因子;篩選IL6刺激顱咽管瘤細胞，檢測其對腫瘤細胞體外遷移特性的影響，初步探討相關作用機制。
　　 結果:顱咽管瘤組織炎性與腫瘤病理類型(x2=6.603，P=0.037)、全切率(x2=8.188，P=0.017)、鈣化(γ=0.326，P=0.022)和術后患者HSS評分(γ=0.376，P=0.008)相關;IL6等多種炎癥因子在不同炎癥等級腫瘤組織中差異表達;IL6-IL6Rα-GP1

19、30在部分顱咽管瘤中表達;腫瘤囊液、腫瘤細胞和腫瘤相關成纖維細胞上清中可檢測出sIL6R的表達;IL6促進釉質上皮型顱咽管瘤細胞體外遷移能力，并有濃度依賴性(F=112.390，P＜0.0001; F=126.654，P＜0.0001);IL6可以增強腫瘤細胞Vimentin的表達，減弱E-cadherin的表達。
　　 結論:顱咽管瘤組織炎性與腫瘤病理類型、全切率、鈣化程度和術后患者下丘腦功能相關，炎癥反應重的患者大塊鈣化出現