釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤實驗?zāi)Ｐ徒⒓癐L-6對釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞體外遷移特性的影響.pdf

1、顱咽管瘤(Craniopharyngioma，CP)是一種沿顱咽管路徑生長的顱內(nèi)上皮來源的軸外腫瘤，多位于鞍區(qū)或鞍旁區(qū)域，是顱內(nèi)最常見的先天性腫瘤之一。顱咽管瘤約占所有兒童顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的6-13％，特別是在鞍區(qū)兒童腫瘤中占60％以上。1904年，奧地利神經(jīng)病理學(xué)家Jakob Erdheim首次將顱咽管瘤作為一類單獨存在的鞍區(qū)腫瘤進行了詳細(xì)的描述，100多年過去了，國內(nèi)外廣大學(xué)者對顱咽管瘤進行了廣泛而深入的研究，但限于該腫瘤研究平臺的缺

2、乏和技術(shù)條件的制約，目前對于其腫瘤起源、病理特征、腫瘤生物學(xué)特性等方面的認(rèn)識仍有很大爭議。
　　 顱咽管瘤屬于良性腫瘤，國際衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)腫瘤病理分類為Ⅰ級，按組織形態(tài)可分為釉質(zhì)上皮型(Adamantinomatous craniopharyngioma，ACP)和鱗狀乳頭型(Squamous papillary craniopharyngioma，SPCP)兩個亞型。相較

3、于后者，釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤常形成指狀突起侵襲周圍腦組織，術(shù)中全切腫瘤困難，術(shù)后易復(fù)發(fā)，臨床預(yù)后也差于后者。國外多個單中心大宗隨訪結(jié)果也提示釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤患者預(yù)后較鱗狀乳頭型差，但具體機制尚不清楚。多年來，由于缺乏穩(wěn)定的體外及體內(nèi)模型，國內(nèi)外學(xué)者主要在組織學(xué)層面對釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤進行了大量研究，但相關(guān)基礎(chǔ)研究進展緩慢;少數(shù)學(xué)者對釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞進行了體外培養(yǎng)并應(yīng)用于功能實驗，但文中均未對腫瘤細(xì)胞特性進行相關(guān)描述，體內(nèi)移植瘤模型

4、也少有報道。我們有必要對釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤實驗?zāi)Ｐ瓦M一步探索，為深入了解該腫瘤生物學(xué)特性和發(fā)生發(fā)展規(guī)律提供新的研究手段。
　　 我課題組前期研究中發(fā)現(xiàn):顱咽管瘤，特別是釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤與周邊正常神經(jīng)組織常形成炎癥粘連，導(dǎo)致術(shù)中難以全切腫瘤，術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)，炎癥程度與患者預(yù)后明顯相關(guān);自發(fā)的顱咽管瘤囊性結(jié)構(gòu)破裂和術(shù)中囊液滲漏?？蓪?dǎo)致無菌性腦膜炎的發(fā)生;組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞周圍常形成密實的膠質(zhì)增生帶和大量炎癥細(xì)胞侵

5、潤。這些現(xiàn)象說明顱咽管瘤細(xì)胞或腫瘤間質(zhì)細(xì)胞可能通過產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子調(diào)節(jié)腫瘤炎癥的發(fā)生發(fā)展，影響患者預(yù)后。Mori曾報道白細(xì)胞介素6(Inierleukin-6，IL6)在顱咽管瘤中異常表達，可能是導(dǎo)致顱咽管瘤炎癥的重要炎性介質(zhì)，影響患者預(yù)后;但限于缺乏可靠的實驗手段，作者并未繼續(xù)在體外或體內(nèi)進行相關(guān)功能實驗深入研究，其具體作用機制尚不清楚。
　　 IL6是一種重要的多功能細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)造血、免疫與炎癥反應(yīng)，與細(xì)胞凋亡、增

6、殖、損傷修復(fù)等密切相關(guān)，也參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)和心血管系統(tǒng)的重要生理功能。同時，IL6在大腸癌、乳腺癌等多種上皮性腫瘤以及腦膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)腫瘤中均有高表達，且與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。IL6可以通過腫瘤細(xì)胞“自分泌”或腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞“旁分泌”等途徑，與相應(yīng)受體結(jié)合形成復(fù)合體導(dǎo)致異常信號通路的激活，進而促進腫瘤發(fā)生、腫瘤新生血管形成，腫瘤遷移侵襲能力提高。然而，IL6在釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤中的具體作用尚不清楚。由此，我們假設(shè):釉質(zhì)上皮型顱咽管

7、瘤細(xì)胞及其微環(huán)境中間質(zhì)成分是否也能通過“自分泌”或“旁分泌”的方式分泌IL6，促使腫瘤細(xì)胞特性發(fā)生改變，從而影響患者預(yù)后？
　　 因此，基于釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤基礎(chǔ)研究的需要以及IL6在該腫瘤中可能存在的重要生物學(xué)作用，本研究采用原代培養(yǎng)的方法建立人釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤有限細(xì)胞系，明確其生物學(xué)性狀;采用裸小鼠皮下種植細(xì)胞懸液的方法探討釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤體內(nèi)模型建立的可能性;同時，采用抗體芯片技術(shù)檢測不同炎癥分級腫瘤組織中炎癥細(xì)胞因子

8、的表達，外源性IL6刺激釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞，明確IL6對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的作用，并對其相關(guān)作用機制進行初步分析，旨在闡述炎癥與顱咽管瘤間的相互關(guān)系，為臨床治療顱咽管瘤提供新的思路。
　　 第一章第一節(jié)釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞模型的建立與檢測
　　 目的:探討有效的釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，檢測體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞自身生物學(xué)特性。
　　 方法:采用胰酶消化法建立釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤有限細(xì)胞系，并通過濾膜分

9、次過濾法純化細(xì)胞;倒置顯微鏡、HE染色觀察生長情況及細(xì)胞形態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定腫瘤表型，噻唑藍比色法繪制細(xì)胞生長曲線，并用流式細(xì)胞技術(shù)分析腫瘤細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果:本次原代培養(yǎng)成功率為88.9％，其中原代細(xì)胞可傳代率為81.3％。人釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中呈貼壁生長，腫瘤細(xì)胞常成小團狀生長，體積大，胞漿豐富，可見少量氣泡狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形“上皮樣”形態(tài)，胞核成圓形，體移較大。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定Pan-c

10、k在釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)表達，證實其上皮性來源。腫瘤細(xì)胞體外增殖緩慢，但第1-5天細(xì)胞增殖率均有差異(F=190.748，P＜0.0001)，細(xì)胞周期顯示腫瘤細(xì)胞均在正常二倍體范圍內(nèi)，未見異倍體細(xì)胞出現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞多處于G0-G1期，46.8±3.61％;部分處于G2-M期，37.3±1.51％;少部分處于S期，15.9±2.77％。
　　 結(jié)論:采用有血清貼壁培養(yǎng)法可以建立釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤有限細(xì)胞系模型。通過濾膜分次過

11、濾等特殊處理方法，可有效地對釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤進行分離、培養(yǎng)和擴增，有利于后續(xù)實驗的進行,釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞呈現(xiàn)Pan-CK陽性表型，細(xì)胞主要處于G0-G1期，體外增殖緩慢，倍體分析未見異倍體細(xì)胞。
　　 第一章第二節(jié)人釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤裸鼠皮下移植瘤模型的初步建立
　　 目的:在前期釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤有限細(xì)胞系建立的基礎(chǔ)上，初步建立人釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤的裸鼠皮下移植瘤模型。
　　 方法:采用胰酶消化法將新鮮

12、的釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤組織原代培養(yǎng)，常規(guī)傳代，然后將純化的第三代顱咽管瘤細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種到BALB/c裸小鼠背部皮下或腋下，觀察接種成瘤后腫瘤組織生長情況和特點，明確腫瘤基本性質(zhì)。
　　 結(jié)果:利用體外培養(yǎng)的釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞種植于裸小鼠皮下可以建立該腫瘤移植瘤模型。顱咽管瘤細(xì)胞可以在裸鼠皮下存活，接種后8天可見有移植瘤形成，背部成瘤率約為37.5％，病理切片顯示腫瘤樣鱗狀上皮細(xì)胞團增生。
　　 結(jié)論:通過顱咽管

13、瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)，裸鼠皮下種植已純化的腫瘤細(xì)胞懸液可以建立顱咽管瘤移植瘤動物模型，有可能作為顱咽管瘤基礎(chǔ)研究的有效手段。但目前該模型尚不穩(wěn)定，成瘤率較低，需要更多的研究優(yōu)化該移植瘤建立的條件。
　　 第二章第一節(jié)顱咽管瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達及臨床病理聯(lián)系
　　 目的:檢測顱咽管瘤，特別是腫瘤正常組織交界處上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白( Vimentin，E-cadherin，β-catenin)表達，聯(lián)系臨床病理和預(yù)后進行相

14、關(guān)分析。
　　 方法:運用免疫組化和免疫熒光方法檢測42例顱咽管瘤中Vimentin，E-cadherin，β-catenin的表達，聯(lián)系臨床病理特征和預(yù)后進行相關(guān)分析。
　　 結(jié)果:腫瘤整體和腫瘤正常組織交界處，釉質(zhì)上皮型和鱗狀乳頭型顱咽管瘤兩亞型間Vimentin，E-cadherin表達均有顯著差別(x2=11.181，P=0.004，x2=6.931，P=0.031;x2=17.393，P＜0.001，x2=8.

15、501，P=0.014);腫瘤正常組織交界處，β-catenin核/漿表達在兩亞型腫瘤中有顯著差別(x2=19.765，P＜0.001)。整體范圍內(nèi)，Vimentin和E-cadherin表達與腫瘤復(fù)發(fā)、術(shù)后體重和下丘腦功能紊亂相關(guān)(x2=23.834，P＜0.001，r=0.643,P＜0.001，r=0.637,P＜0.001;x2=16.526,P＜0.001，r=-0.579,P＜0.001,r=-0.714，P＜0.001);

16、腫瘤正常組織交界處，Vimentin和E-cadherin/β-catenin表達與腫瘤復(fù)發(fā)、術(shù)后體重和下丘腦功能紊亂相關(guān)(x2=19.782，P＜0.001，r=0.642，P＜0.001，r=0.573,P=0.001;x2=11.475,P=0.003，r=-0.54,P＜0.001，r=-0.626,P＜0.001; x2=16.572,P＜0.001，r=-0.54,P＜0.001,r=-0.506,P=0.001)。

17、　　 結(jié)論:本研究首次證實顱咽管瘤組織中Vimentin，E-cadherin和β-catenin表達與腫瘤預(yù)后相關(guān);上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有可能是影響顱咽管瘤進程的重要機制之一。
　　 第二章第二節(jié)IL-6對釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞體外遷移特性的影響
　　 目的:探討IL6對釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞遷移特性的影響及其相關(guān)作用機制。
　　 方法:回顧性分析炎癥等級與顱咽管瘤臨床病理特點的相關(guān)性;采用抗體芯片檢測不同炎癥等級的

18、釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤組織的差異炎癥細(xì)胞因子;篩選IL6刺激顱咽管瘤細(xì)胞，檢測其對腫瘤細(xì)胞體外遷移特性的影響，初步探討相關(guān)作用機制。
　　 結(jié)果:顱咽管瘤組織炎性與腫瘤病理類型(x2=6.603，P=0.037)、全切率(x2=8.188，P=0.017)、鈣化(γ=0.326，P=0.022)和術(shù)后患者HSS評分(γ=0.376，P=0.008)相關(guān);IL6等多種炎癥因子在不同炎癥等級腫瘤組織中差異表達;IL6-IL6Rα-GP1

19、30在部分顱咽管瘤中表達;腫瘤囊液、腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞上清中可檢測出sIL6R的表達;IL6促進釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞體外遷移能力，并有濃度依賴性(F=112.390，P＜0.0001; F=126.654，P＜0.0001);IL6可以增強腫瘤細(xì)胞Vimentin的表達，減弱E-cadherin的表達。
　　 結(jié)論:顱咽管瘤組織炎性與腫瘤病理類型、全切率、鈣化程度和術(shù)后患者下丘腦功能相關(guān)，炎癥反應(yīng)重的患者大塊鈣化出現(xiàn)