GITR信號在ConA誘導的小鼠急性自身免疫性肝損害中的作用.pdf

1、第一部分 ConA 誘導的小鼠急性自身免疫性肝損害模型的建立和HSC 活化水平的變化
　　 目的：研究刀豆蛋白A（ConA）注射引起的小鼠急性免疫性肝損傷的病變規(guī)律及HSC活化水平的變化，并探討HSC在小鼠急性自身免疫性肝損害發(fā)病機制中的作用。
　　 方法：雌性昆明小鼠（7-9周齡）隨機分為5組，其中按造模時間點不同分為4組，即2h、8h、24h、48h，另設一組為正常對照組，每組均設小鼠8只。模型組給予ConA（20m

2、g/kg）尾靜脈注射制備小鼠急性自身免疫性肝損傷模型，對照組小鼠給予等量生理鹽水尾靜脈注射。分別于造模后2h、8h、24h、48h 麻醉各對應時間點模型組小鼠和對照組小鼠，抽取心臟血液，分離肝臟及脾臟標本。
　　 新鮮獲取的肝臟及脾臟進行稱重，計算肝脾指數(shù)。應用全自動生化儀分析檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），白蛋白（A），球蛋白（G）等肝功能指標變化。石蠟切片HE 染色觀察各個時間點小鼠肝臟病理變化。應用EL

3、ISA 方法檢測小鼠血清TGF-β1 及TGF-β3 濃度，免疫組化方法檢測肝臟組織中HSC 活化標志物ɑ-平滑肌肌動蛋白（ɑ-SMA）及波形蛋白（Vimentin）的表達，應用Western-blot 方法檢測肝臟組織TGF-β1、TGF-β3、ɑ-SMA 及Vimentin 蛋白相對表達量。
　　 結果：
　　 （1）給藥后2h模型組轉(zhuǎn)氨酶（ALT，AST）水平均較正常對照組有升高趨勢，但未達統(tǒng)計學差異，給藥8h后模

4、型組轉(zhuǎn)氨酶水平達峰值，其中ALT達208.8±107.5U/L，AST 達558.5±180.1U/L，與對照組（ALT 為38.8±8.9U/L，AST 為136±24U/L）相比有顯著差異，給藥后24h 及48h 轉(zhuǎn)氨酶仍較正常對照組增高，但較8h組為低。各處理組白蛋白和球蛋白未見明顯統(tǒng)計學差異，造模組8h、24h 及48h 血清白蛋白有降低趨勢，而血清球蛋白有增高趨勢，但均無統(tǒng)計學差異；
　　 （2）肝脾指數(shù)變化：注射Co

5、nA后，小鼠肝脾指數(shù)出現(xiàn)升高趨勢，均于8h 達到峰值，其中肝指數(shù)達6.15±1.53，脾指數(shù)達1.93±0.14。2h模型組小鼠肝指數(shù)與對照組（4.46±0.32）比較未見明顯統(tǒng)計學差異，而該時間點模型組小鼠脾指數(shù)已增高至1.59±0.10，較對照組顯著升高；
　　 （3）肝組織學表現(xiàn)：2h組肝組織出現(xiàn)輕度充血，匯管區(qū)輕度淋巴細胞浸潤，肝細胞形態(tài)尚正常，肝索排列稍紊亂。8h組肝臟明顯充血，肝竇、肝索基本消失，細胞脂肪變性，匯管區(qū)

6、大量炎性細胞浸潤。24h組肝組織充血，肝細胞變性，匯管區(qū)炎性細胞浸潤。48h組小鼠肝細胞輕微變性，匯管區(qū)少量炎性細胞浸潤。
　　 （4）注射ConA后，免疫組化及Western-blot結果顯示小鼠HSC 活化標志物ɑ-SMA 及Vimentin表達較正常對照組明顯升高，其中8h組ɑ-SMA 及Vimentin 蛋白相對表達量分別為1.84±0.33 及 2.57±0.61，達峰值；
　　 （5）注射ConA后各時間點血

7、清TGF-β1表達有升高趨勢，其中于8h組為36.43±9.67pg/ml，達峰值，與正常組有顯著差異，肝臟TGF-β1 蛋白表達與血清水平基本一致；
　　 （6）注射ConA后2h 至8h，小鼠血清TGF-β3 較正常組明顯增高，其中以8h 更為顯著，P<0.01，24h 及48h時間點TGF-β3表達開始下降，且較正常組為低，肝臟TGF-β3 蛋白表達與血清水平一致。
　　 結論：
　　 （1）尾靜脈注射Co

8、nA 可制備小鼠自身免疫性肝損害模型，觀察所見具有時效性，其中在注射后8h 小鼠肝損害最為嚴重，24 小時以后肝臟出現(xiàn)自我修復。
　　 （2）在ConA 誘導的小鼠急性自身免疫性肝損傷過程中，HSC 存在早期被激活，并且與肝功能損傷有相關性，TGF-β1 及TGF-β3在模型早期的表達失衡可能與自身免疫性肝炎容易發(fā)生和進展為肝硬化有關。
　　 第二部分 GITR信號對ConA誘導的小鼠急性自身免疫性肝損害病變的影響

9、>　　 目的：研究GITR/GITRL 信號通路在ConA 誘發(fā)的急性自身免疫性肝損害發(fā)病機制中的作用。
　　 方法：雌性昆明小鼠（7-9周齡）隨機分為正常對照組，ConA模型組及Fc-GITR 干預組，模型組設4組時間點，即2h、8h、24h、48h，F(xiàn)c-GITR 干預組設3組時間點，即8h、24h、48h。模型組采用ConA（20mg/kg）尾靜脈注射制備小鼠急性自身免疫性肝損害模型；Fc-GITR 干預組在相應時間點預

10、先給予腹腔注射Fc-GITR（5μg/只），1分鐘后再給予ConA 尾靜脈注射（20mg/kg）；對照組小鼠給予等量生理鹽水尾靜脈注射。注射后于相應時間點，麻醉各組存活小鼠，抽取心臟內(nèi)血液，分離肝臟標本，并分離脾臟單個核細胞（SPMC）。檢測各組血清ALT，AST，白蛋白（A），球蛋白（G）等肝功能指標。應用Real-time PCR和Western-blot 方法檢測各時間點模型組和對照組肝臟組織及SPMC中GITR、GITRL表達情

11、況。
　　 結果：
　　 （1）給藥后2h模型組轉(zhuǎn)氨酶（ALT，AST）較正常對照組有升高趨勢，但無統(tǒng)計學差異，給藥后8h 及24h模型組轉(zhuǎn)氨酶較對照組明顯升高，其中8h 達峰值。Fc-GITR 干預組轉(zhuǎn)氨酶水平在相應時間點均較模型組低，而與對照組無統(tǒng)計學差異。各相應時間點及各處理組白蛋白和球蛋白未見無明顯差異。
　　 （2）Fc-GITR 干預組小鼠在8h 及24h 時間點肝、脾指數(shù)均較模型組顯著降低，同時干預

12、組小鼠死亡率也較模型組顯著降低。
　　 （3）組織學表現(xiàn)：8h模型組小鼠出現(xiàn)肝臟明顯充血肝竇、肝索基本消失，細胞脂肪變性，匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤；24h組小鼠肝臟充血，肝細胞變性，匯管區(qū)炎性細胞浸潤。Fc-GITR 預處理后，各個時間段損傷均明顯減輕。對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，中央靜脈不充血。
　　 （4）8h模型組小鼠肝組織及SPMC中GITR和GITRL基因表達均較正常對照組明顯增高，其余時間點未見明顯

13、統(tǒng)計學改變。
　　 （5）8h模型組小鼠肝組織及SPMC中GITR 蛋白相對表達量變化與基因表達一致，而模型組各時間點GITRL 蛋白相對表達量無明顯統(tǒng)計學改變。
　　 結論：上述結果顯示，拮抗GITR 信號可減輕ConA 誘導的小鼠急性自身免疫性肝損傷的病變程度，提示GITR/GITRL 可能參與了ConA 誘導的小鼠急性自身免疫性肝損害的病變過程，在其發(fā)病中可能起一定的作用。
　　 第三部分 GITR信號對C

14、onA誘導的小鼠急性自身免疫性肝損害模型及體外HSC 活化的影響
　　 目的：研究GITR/GITRL 對ConA 誘發(fā)的急性自身免疫性肝損害模型及體外HSC 活化水平的影響。
　　 方法：
　　 （1）體內(nèi)實驗：雌性昆明小鼠（7-9周齡）隨機分為三組，模型組、Fc-GITR干預組及正常對照組，三組處理方法同前。ConA 注射后8h、48h 麻醉各組小鼠，行心臟取血，摘取肝臟及脾臟。應用ELISA 方法和West

15、ern-blot 方法檢測各組小鼠血清及肝臟TGF-β1 及TGF-β3表達水平；應用免疫熒光及Western-blot方法檢測各組小鼠HSC 活化標志蛋白（Vimentin）的蛋白表達。
　　 （2）體外實驗：應用Percoll 淋巴細胞分離液提取各組小鼠新鮮摘取的脾臟單個核細胞（SPMC），與原代小鼠HSC 共培養(yǎng)，觀察各組HSC 增殖活化情況；將預先應用Fc-GITR 處理的模型組小鼠脾臟單個核細胞與HSC 共培養(yǎng)，觀察H

16、SC 增殖活化情況。
　　 結果：
　　 （1）給予Fc-GITR 干預后，小鼠肝臟HSC 活化蛋白Vimentin表達明顯較模型組小鼠降低，表明干預GITR 信號后，小鼠HSC 活化情況減弱。
　　 （2）干預組小鼠血清及肝臟TGF-β1 較正常對照組及模型組明顯減少，TGF-β3的蛋白表達與模型組未見明顯統(tǒng)計學差異。
　　 （3）體外實驗顯示，與模型組小鼠脾臟單個核細胞共培養(yǎng)的HSC 活化情況較對照組

17、明顯升高，而與干預組小鼠脾臟單個核細胞共培養(yǎng)的HSC的活化情況較前者明顯減弱，與對照組未見明顯差異，給予Fc-GITR 預處理模型組小鼠SPMC 活化HSC的能力較未給予Fc-GITR 預處理的模型組小鼠SPMC 明顯減弱，與各組小鼠SPMC 共培養(yǎng)的HSC 增殖情況未見明顯變化。
　　 結論：體內(nèi)、體外干預GITR/GITRL 信號可明顯減弱ConA 誘導的小鼠自身免疫性肝損害中HSC 活化，表明GITR 信號可能參與了Con