人高分化喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系FD-LSC-1的建立、鑒定及特征分析.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分:人高分化喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系FD-LSC-1的建立
　　此部分研究旨在通過采集喉癌標(biāo)本組織直接進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)來建立一株新的能夠代表近年來中國(guó)喉癌喉人群部分發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)特征的喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系。
　　本研究中，我們嘗試收集了2011年6月-2011年12月在我院確診為喉鱗狀細(xì)胞癌的40位患者的喉癌組織標(biāo)本，其中會(huì)厭癌29例，聲門癌8例，頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)3例，均為男性患者，

2、年齡46-68歲。將收集的標(biāo)本組織在24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行洗滌、消毒、機(jī)械剪碎及膠原酶消化后直接進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)或組織塊培養(yǎng)，對(duì)生長(zhǎng)出的喉癌上皮細(xì)胞進(jìn)行傳代、純化、流式細(xì)胞儀及免疫熒光純度測(cè)定、定期凍存、支原體污染檢測(cè)及復(fù)蘇活性測(cè)定。同時(shí)采集癌旁正常上皮組織進(jìn)行同法原代培養(yǎng)，作為腫瘤細(xì)胞的對(duì)照。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):喉癌組織或細(xì)胞在體外直接進(jìn)行原代培養(yǎng)比較困難，細(xì)菌及真菌污染和癌細(xì)胞不貼壁是培養(yǎng)過程中的主要問題，即使貼壁生長(zhǎng)，絕大多數(shù)不超過3

3、代。從40例喉癌標(biāo)本中我們僅成功建立了一株新的喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，命名為FD-LSC-1，來自于一位未經(jīng)治療的分化良好的會(huì)厭鱗癌伴雙頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(IVa，T4aN2M0)的68歲男性患者的會(huì)厭病灶，該患者沒有喉癌家族史，但有40余年的吸煙史及30余年的飲酒史。FD-LSC-1細(xì)胞在體外傳代超過100代，癌細(xì)胞已純化，沒有支原體污染，凍存后復(fù)蘇的FD-LSC-1細(xì)胞活性良好。癌旁正常上皮也成功培養(yǎng)傳代到第8代。
　　以上結(jié)果表明:

4、人喉鱗癌FD-LSC-1細(xì)胞系已經(jīng)初步建立達(dá)永生化;喉鱗癌原代細(xì)胞在體外較難成活和培養(yǎng)建系，可能與喉癌病灶大多原發(fā)于有菌腔道且與空氣、消化液或痰液接觸有關(guān);成功建立能夠在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)和連續(xù)傳代的喉鱗癌細(xì)胞系是一項(xiàng)艱苦的工作，需要經(jīng)過多次嘗試和多次失敗才能偶獲成功。
　　第二部分:人高分化喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系FD-LSC-1的鑒定
　　此部分研究旨在對(duì)新建立的喉鱗癌FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，包括三部分內(nèi)容:首先是種屬

5、鑒定，確認(rèn)FD-LSC-1細(xì)胞系是人來源的;其次是細(xì)胞組織來源鑒定，確認(rèn)FD-LSC-1細(xì)胞系是上皮組織細(xì)胞來源的;最后是惡性生物學(xué)特征的鑒定，確認(rèn)FD-LSC-1細(xì)胞系是惡性腫瘤。
　　本研究中，首先利用目前最權(quán)威的短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)圖譜技術(shù)對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系的17個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列基因座及一個(gè)性別決定基因座(Amelogenin)進(jìn)行了檢測(cè)分析，通過美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(Ame

6、ricanType Culture Collection，ATCC)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了種屬鑒定，并與美國(guó)ATCC及歐洲微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(DSMZ，Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)中的遺傳信息進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)有無(wú)被現(xiàn)存的任何細(xì)胞系污染;其次，利用相差顯微鏡觀察FD-LSC-1細(xì)胞的形態(tài)，利用免疫熒光法檢測(cè)FD-LSC-1細(xì)胞廣譜角蛋白及波形蛋白的表

7、達(dá)情況，利用透射電鏡技術(shù)檢查上皮超微結(jié)構(gòu);晟后，對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行了惡性生物學(xué)特征的鑒定，包括:吉姆薩(Giemsa)染色形態(tài)學(xué)觀察、透射電鏡癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查、染色體組核型分析、流式細(xì)胞儀DNA倍體分析、軟瓊脂集落形成能力檢測(cè)及免疫缺陷小鼠致瘤能力的檢測(cè)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):首先，美國(guó)ATCC的檢測(cè)報(bào)告確認(rèn)FD-LSC-1細(xì)胞系是人來源的細(xì)胞系，并且沒有受到美國(guó)ATCC及歐洲D(zhuǎn)SMZ細(xì)胞庫(kù)中任何細(xì)胞系的污染。其次，相差顯微

8、鏡觀察發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細(xì)胞呈鵝卵石樣單層貼壁生長(zhǎng)，胞漿內(nèi)?？梢娍张?，與人喉表皮樣癌HEp-2細(xì)胞系的多邊形不同;細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細(xì)胞為廣譜角蛋白陽(yáng)性而波形蛋白陰性:透射電鏡檢查發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細(xì)胞之間可見橋粒，胞漿內(nèi)可見張力絲等上皮超微結(jié)構(gòu)。最后，對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行的惡性生物學(xué)特征檢測(cè)發(fā)現(xiàn):Giemsa染色的FD-LSC-1細(xì)胞核分裂像明顯活躍，胞核大，核漿比例增大，可見巨核細(xì)胞;透射電鏡癌細(xì)胞超微

9、結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體、核糖體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富;染色體組核型分析提示FD-LSC-1細(xì)胞系存在明顯的數(shù)量異常和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)異常，染色體眾數(shù)為68，為近3倍體，結(jié)構(gòu)異常包括染色體增加、缺失及易位等;流式細(xì)胞儀DNA倍體及細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，與宮頸癌Hela細(xì)胞系相比，F(xiàn)D-LSC-1細(xì)胞系G0/G1期比例下降，S期比例增高，而G2/M期比例類似;FD-LSC-1細(xì)胞系未能夠在半固體軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落;FD-LSC-1

10、細(xì)胞能夠順利在免疫缺陷小鼠皮下形成移植瘤，移植瘤HE(hematoxylin&eosin)染色病理提示為高分化鱗癌。
　　以上結(jié)果表明:經(jīng)過種屬、組織來源及惡性生物學(xué)特征的鑒定，新建立的FD-LSC-1細(xì)胞系符合癌細(xì)胞系所必需的各項(xiàng)生物學(xué)特征，可以確認(rèn)是人喉上皮組織來源的高分化鱗癌細(xì)胞系，且沒有被目前存在的任何細(xì)胞系污染。
　　第三部分:人高分化喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系FD-LSC-1的特征分析
　　此部分研究旨在對(duì)已經(jīng)過鑒

11、定的人高分化喉鱗癌FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行個(gè)性化的特征分析，包括:體外培養(yǎng)群體倍增時(shí)間、遷移侵襲潛能、放化療敏感性、Notch1及EGFR(epidermal growth factor receptor)通路、CK(cytokeratin)5及Ki67的蛋白水平、TP53基因突變、人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染、頭頸鱗癌相關(guān)分子標(biāo)記物檢測(cè)、頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)基因檢測(cè)及頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)microR

12、AN檢測(cè)，為FD-LSC-1細(xì)胞系貼上個(gè)性化的特征標(biāo)簽。本研究中，利用CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行了體外培養(yǎng)的群體倍增時(shí)間測(cè)定，以Hela細(xì)胞系為對(duì)照利用包被基質(zhì)膠的Transwell小室對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行了遷移及侵襲能力的檢測(cè)，再以Hela細(xì)胞系為對(duì)照利用X射線及順鉑對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系進(jìn)行了放化療敏感性的檢測(cè)，利用Western Blot技術(shù)對(duì)FD-LSC-1細(xì)

13、胞系的Notch1、EGFR、CK5及Ki67的蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)，利用基因測(cè)序技術(shù)對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系TP53抑癌基因的全部外顯子進(jìn)行了突變檢測(cè)，利用兩對(duì)通用引物結(jié)合PCR(polymerase chainreaction)技術(shù)對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系的HPV感染情況進(jìn)行了檢測(cè)，利用免疫組化和免疫熒光技術(shù)對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系的頭頸鱗癌相關(guān)重要分子標(biāo)記進(jìn)行了檢測(cè)，利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR，q

14、uantitative real-timepolymerase chain reaction)對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系的頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)基因進(jìn)行了檢測(cè)以及利用TaqMan探針qRT-PCR技術(shù)對(duì)FD-LSC-1細(xì)胞系頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)miRNA進(jìn)行了檢測(cè)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):FD-LSC-1細(xì)胞系在體外培養(yǎng)的群體倍增時(shí)間約為24小時(shí)，F(xiàn)D-LSC-1細(xì)胞系比Hela細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移及侵襲潛能但對(duì)放化療相對(duì)更敏感，F(xiàn)D-LSC-1細(xì)胞系

15、具有激活的Notch1和EGFR信號(hào)通路以及上調(diào)的CK5和Ki67蛋白水平，F(xiàn)D-LSC-1細(xì)胞系TP53基因第5和8外顯子分別發(fā)生了錯(cuò)義突變和無(wú)義突變，F(xiàn)D-LSC-1細(xì)胞系沒有被HPV感染，F(xiàn)D-LSC-1細(xì)胞系表達(dá)ADAM10及MLH1等重要的頭頸鱗癌相關(guān)分子標(biāo)記物，SYBR Green qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了FD-LSC-1細(xì)胞系有TERT等14個(gè)頭頸鱗癌相關(guān)上調(diào)基因及KRT4等14個(gè)下調(diào)基因，TaqMan探針qRT-PCR技