雙氫睪酮對(duì)Aβ誘導(dǎo)的突觸后致密區(qū)損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年期癡呆癥中最常見(jiàn)的一種類型，臨床以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為主要特征。多項(xiàng)研究證明突觸喪失程度與癡呆及早期AD分期最好的相關(guān)性，突觸喪失是AD早期發(fā)病過(guò)程中一個(gè)突出的病理學(xué)改變，在老年斑塊形成之前即可導(dǎo)致認(rèn)知功能減退，是AD患者學(xué)習(xí)記憶功能減退的病理學(xué)基礎(chǔ)，與認(rèn)知功能減退有較好的相關(guān)性。
　　大量研究結(jié)果顯示，可溶性的β淀粉樣蛋白(amyloidβ，Aβ

2、)寡聚體可以導(dǎo)致認(rèn)知功能減退，尤其是在發(fā)病的早期階段。動(dòng)物研究中，Aβ寡聚體可以引起快速學(xué)習(xí)障礙、包括突觸可塑性在內(nèi)的突觸機(jī)制障礙以及突觸后膜的突觸后致密區(qū)(post-synaptic density，PSD)結(jié)構(gòu)的損傷。PSD是突觸后膜上的關(guān)鍵性功能區(qū)，參與突觸前、后大量分子聯(lián)系與突觸功能調(diào)控，因此是突觸的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)與功能單位之一。
　　在分子水平上，PSD是由突觸后致密蛋白-95(post-synaptic densitypro

3、tein-95，PSD-95)、Homer-1、Shank等蛋白分子為核心分子構(gòu)筑的突觸后膜關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元。PSD的發(fā)育與神經(jīng)元突觸(synapse)、樹(shù)突棘(spine)發(fā)育呈現(xiàn)正相關(guān)聯(lián)系。PSD結(jié)構(gòu)與功能的異常直接影響神經(jīng)元突觸的發(fā)育與功能狀態(tài)。因此，探討Aβ對(duì)PSD的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)分子PSD-95、Homer-1等蛋白分子表達(dá)的影響，對(duì)我們進(jìn)一步闡明AD突觸損傷機(jī)制、改善AD患者認(rèn)知功能障礙有重要的意義。
　　同時(shí)，隨著年齡的增長(zhǎng)，

4、腦中亦存在雄激素水平的下降，在影響骨密度、性功能的同時(shí)，大腦功能，如情緒、認(rèn)知和記憶也受到一定的影響，包括阿爾茨海默病在內(nèi)的年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病也與雄激素的下降有關(guān)。在成年動(dòng)物體內(nèi)，雄激素與神經(jīng)元可塑性以及海馬CA1區(qū)樹(shù)突棘突觸密度的調(diào)節(jié)有關(guān)。因此我們推測(cè)，雄激素可能存在重要的突觸保護(hù)作用。
　　先前的研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt、MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)與功能活動(dòng)具有關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。而近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)，雄激素可以激

5、活神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的PI3K/Akt、MAPK/ERK信號(hào)通路而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，通過(guò)探索雄激素對(duì)大腦神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)與功能可能存在的保護(hù)作用及其機(jī)制，或可為阿爾茨海默病等突觸受損疾病的防治提供臨床和藥理借鑒，具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　目的:
　　采用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)作為神經(jīng)元體外研究模型，觀察Aβ對(duì)突觸后致密區(qū)的損傷作用，并進(jìn)一步探討雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)可能存

6、在的對(duì)抗Aβ而產(chǎn)生的突觸保護(hù)作用及PI3K/Akt、MAPK/ERK通路在其突觸保護(hù)過(guò)程中的作用，為雄激素預(yù)防或治療阿爾茨海默病(AD)提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.Aβ對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)元PSD蛋白分子表達(dá)及PI3K/Akt、MAPK/ERK信號(hào)通路的影響
　　1.1Aβ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞PSD蛋白表達(dá)的影響
　　分別設(shè)不同濃度梯度的Aβ142、Aβ25-35作用組，采用western-blot法檢測(cè)

7、其對(duì)PSD-95、Homer-1蛋白表達(dá)的影響。
　　1.2Aβ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞PI3K/Akt、MAPK/ERK信號(hào)通路的影響
　　分別設(shè)不同濃度梯度的Aβ1-42、Aβ25-35處理組，采用western-blot法檢測(cè)其對(duì)p-Akt、p-ERK1/2的磷酸化激活的影響。
　　2.DHT對(duì)SH SY5Y神經(jīng)元PSD蛋白分子表達(dá)及PI3K/Akt、MAPK/ERK信號(hào)通路的影響
　　2.1DHT對(duì)SH-SY

8、5Y神經(jīng)元PSD蛋白表達(dá)的影響
　　不同濃度梯度的DHT作用組，采用western-blot法檢測(cè)PSD-95、Homer-1蛋白的表達(dá)變化。
　　2.2DHT對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)元PI3K/Akt、MAPK/ERK信號(hào)通路的影響
　　不同濃度梯度的DHT作用于SH SYSY細(xì)胞，western-blot法檢測(cè)p-Akt、p-ERK1/2的磷酸化水平變化。
　　3.DHT對(duì)Aβ1-42、Aβ25-35誘導(dǎo)的PSD

9、結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)下調(diào)的影響及分子機(jī)制
　　Western-blot方法觀察DHT對(duì)Aβ1-42、Aβ25-35處理后的PSD-95、Homer-1蛋白表達(dá)的影響，并觀察PI3K/Akt阻斷劑LY294002、MAPK/ERK阻斷劑U0126對(duì)DHT作用的影響。
　　4.Aβ1-42、Aβ25-35及DHT對(duì)神經(jīng)元及突觸后致密區(qū)(PSD)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)影響
　　采用Homer-1間接免疫熒光方法，共聚焦顯微鏡觀察Aβ1-42、

10、Aβ25-35或/和DHT處理后神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞突起數(shù)量、突起長(zhǎng)度及突觸連接和突觸PSD）的形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　1.Aβ1-42、Aβ25-35以濃度依賴的方式下調(diào)PSD蛋白分子PSD-95、Homer-1的表達(dá);而且，Aβ1-42、Aβ25-35還可以濃度依賴性地抑制Akt及ERK的磷酸化激活。
　　2.DHT以濃度依賴的方式上調(diào)支架蛋白PSD-95、Homer-1的表達(dá)，同時(shí)還可以濃度依賴性地促進(jìn)

11、Akt及ERK的磷酸化激活。
　　3.DHT可以明顯抑制Aβ142、Aβ2535誘導(dǎo)的神經(jīng)元突觸PSD-95、Homer-1表達(dá)下調(diào)作用，而PI3K抑制劑LY294002及MEK抑制劑U0126可明顯抑制DHT的抗Aβ1-42、Aβ2535突觸蛋白下調(diào)的保護(hù)作用。
　　4.共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42、Aβ25-35寡聚體分別處理后的神經(jīng)元細(xì)胞突起數(shù)量減少、突起長(zhǎng)度明顯縮短，細(xì)胞間突觸連接大大減少;而DHT預(yù)處理后，A

12、β1-42、Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元突觸損傷效應(yīng)明顯受到抑制。
　　結(jié)論:
　　1.在體外SH-SY5Y神經(jīng)元模型上，我們發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42、Aβ25-35可以明顯下調(diào)PSD支架蛋白PSD-95、Homer-1的表達(dá);同時(shí)，Aβ1-42、Aβ25-35也可以明顯抑制神經(jīng)元Akt及ERK1/2的磷酸化激活，進(jìn)一步抑制PI3K/Akt及MAPK/ERK信號(hào)通路。
　　2.在體外SH-SY5Y神經(jīng)元模型上，DHT可以明顯抑

13、制Aβ1-42、Aβ25-35誘導(dǎo)的PSD支架蛋白PSD-95、Homer-1表達(dá)下調(diào);同時(shí)，DHT可以明顯促進(jìn)神經(jīng)元Akt及ERK1/2的磷酸化激活，進(jìn)一步激活PI3K/Akt及MAPK/ERK信號(hào)通路;此外，PI3K抑制劑LY294002及MEK抑制劑U0126可明顯抑制DHT的抗Aβ1-42、Aβ25-35突觸蛋白下調(diào)作用。因此，我們推測(cè)，DHT可能通過(guò)激活PI3K/Akt及MAPK/ERK信號(hào)通路而產(chǎn)生抗Aβ142、Aβ25-3