基于熒光報(bào)告載體的農(nóng)桿菌atu5117基因啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控影響因素的研究.pdf

1、農(nóng)桿菌是一類能夠在土壤中生存的植物病原菌。根癌農(nóng)桿菌能侵染受傷植物細(xì)胞，將自身基因插入到植物基因組內(nèi)遺傳表達(dá)，借助農(nóng)桿菌的侵染，可實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，即可再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是植物轉(zhuǎn)基因和植物遺傳改良的首選方法，但其轉(zhuǎn)化效率低和轉(zhuǎn)化結(jié)果的不可預(yù)測性是該轉(zhuǎn)基因技術(shù)面臨的重要問題。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到農(nóng)桿菌細(xì)胞附著在植物細(xì)胞傷口，T-DNA在農(nóng)桿菌和宿主細(xì)胞中的

2、轉(zhuǎn)移，T-DNA整合到宿主細(xì)胞及在宿主細(xì)胞內(nèi)的遺傳轉(zhuǎn)化等多個(gè)過程。我們嘗試進(jìn)一步了解農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)過程的分子機(jī)理，探討是否可以通過提高T-復(fù)合物招募蛋白VBPs在農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)活性來提高T-DNA的轉(zhuǎn)化效率，此研究對其在植物轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用具有重要意義。
　　本文對編碼農(nóng)桿菌T-復(fù)合物招募蛋白VBPs的基因atu5117啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究。在農(nóng)桿菌啟動(dòng)子基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究中，多以單熒光gfp基因作為啟動(dòng)子報(bào)

3、告基因，但是表達(dá)產(chǎn)物除了受啟動(dòng)子因素的影響外還受載體拷貝數(shù)的影響，以往的單熒光gfp檢測方法不能排除載體拷貝數(shù)的干擾，使實(shí)驗(yàn)存在很大的誤差。為了解決上述問題，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建雙熒光指示載體pUCA19-GFP/RFP，將紅色熒光蛋白rfp因作為載體拷貝數(shù)的報(bào)告基因，以便了解不同實(shí)驗(yàn)條件下atu5117啟動(dòng)子基因表達(dá)調(diào)控過程中載體拷貝數(shù)的影響。將帶有rfp基因的組成型表達(dá)的農(nóng)桿菌atu3617啟動(dòng)子和帶有g(shù)fp基因的農(nóng)桿菌atu5117啟動(dòng)子與

4、農(nóng)桿菌表達(dá)載體pUCA19連接，構(gòu)建出雙熒光指示載體pUCA19-GFP/RFP，通過檢測該載體在不同菌種和不同環(huán)境條件下的熒光表達(dá)活性的不同，來對atu5117啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究。通過熒光檢測農(nóng)桿菌重組載體pUCA19-GFP/RFP能發(fā)出紅綠熒光，通過基因組測序檢測農(nóng)桿菌重組載體pUCA19-GFP/RFP含有雙熒光報(bào)告基因片段。檢測結(jié)果表明農(nóng)桿菌雙熒光指示載體pUCA19-GFP/RFP構(gòu)建成功。通過不同濃度蛋白測定熒光

5、強(qiáng)度顯示，熒光強(qiáng)度與熒光蛋白表達(dá)量之間存在線性關(guān)系。
　　在大腸桿菌異源表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌中atu5117啟動(dòng)子的表達(dá)活性明顯高于在農(nóng)桿菌GMI9017和農(nóng)桿菌GMI9017△2中的表達(dá)活性，atu5117啟動(dòng)子活性隨著生長期變化，在對數(shù)期活性最高，可以推測atu5117啟動(dòng)子的啟動(dòng)表達(dá)具有一定的時(shí)序性。在不同生長條件下，大腸桿菌中的農(nóng)桿菌atu5117啟動(dòng)子活性不受AS濃度影響，可能因?yàn)榇竽c桿菌中沒有VirA-VirG等A

6、S的響應(yīng)機(jī)制。在堿性pH環(huán)境下，atu5117啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)活性變化不規(guī)律，在酸性pH環(huán)境下活性上升趨勢明顯，可能與農(nóng)桿菌侵染植物過程中對酸性物質(zhì)的趨化性相關(guān)。啟動(dòng)子活性受溫度的影響明顯，atu5117啟動(dòng)子活性隨著溫度上升，可能與細(xì)胞抵御高溫的機(jī)制有關(guān)。
　　在農(nóng)桿菌表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)中，atu5117啟動(dòng)子活性隨著生長期變化，啟動(dòng)子活性在對數(shù)期達(dá)到最大。在缺失同源基因atu4860的GMI9017A2中，農(nóng)桿菌atu5117啟動(dòng)子的