基于DNA環(huán)調(diào)控的rrnB P1嵌合啟動子表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、表達載體的構(gòu)建是實現(xiàn)高效表達的關(guān)鍵步驟,而作為表達載體組成元件之一的啟動子是非常重要的。理想的啟動子應(yīng)具有以下特性:作用強,嚴格調(diào)控,易轉(zhuǎn)導(dǎo)入其他E.coli以便篩選大量的用于生產(chǎn)蛋白的菌株,而且對其誘導(dǎo)是簡便和廉價的.在大腸桿菌表達系統(tǒng)中,大部分表達載體采用誘導(dǎo)型啟動子控制目的基因的表達.誘導(dǎo)型啟動子能控制基因在特定時期、特定部位表達,這既避免了目的基因在宿主細胞內(nèi)高表達對宿主細胞生長的影響,又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。目前在

2、外源基因表達中使用的大部分大腸桿菌啟動子均來自相應(yīng)操縱元,它們都帶有可與阻遏蛋白特異性結(jié)合的操縱子區(qū)域。
　　 來源于大腸桿菌且有著超強能力的rRNA P1啟動子是由包括-10區(qū)和-35區(qū)的核心啟動子、一個順式作用元件(UP元件)和3到5個反式作用轉(zhuǎn)錄因子(Fis)的結(jié)合位點組成的,但它們?nèi)晕幢挥糜贓.coli進行高水平表達,其主要原因是難以對其進行調(diào)控。本研究的意義就在于通過可行的方式實現(xiàn)對rRNA P1啟動子的調(diào)控.

3、　　 本文首先利用大腸桿菌阿拉伯糖操縱元通過DNA環(huán)實現(xiàn)調(diào)控轉(zhuǎn)錄的特點,應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建嵌合啟動子.以此啟動子為基礎(chǔ)構(gòu)建了表達載體pRBB。以β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因cel5G作為報告基因證實該重組表達載體可以接近pET系列商業(yè)化載體的效率進行表達.但宿主菌中的AraC調(diào)節(jié)蛋白不足以抑制啟動子的轉(zhuǎn)錄,因此,另外構(gòu)建了調(diào)節(jié)基因araC的重組質(zhì)粒,通過雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化實現(xiàn)了對啟動子的調(diào)控.
　　 同一宿主菌中的不相容性雙質(zhì)粒

4、在傳代中存在著分配上的不均一性,這在一定程度上影響了表達的穩(wěn)定性.為了消除這一影響,同時為了更進一步驗證DNA環(huán)的調(diào)控作用,我們利用大腸桿菌乳糖操縱元調(diào)控轉(zhuǎn)錄的特點,應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建兩種嵌合啟動子.其中一種是含rRNA rrnB P1啟動子序列和兩個lacO操縱子的嵌合啟動子,分別位于核心啟動子-10區(qū)下游和Fis結(jié)合位點上游,且兩個lacO操縱子之間的距離是92 bp,當有阻遏蛋白(LacⅠ)存在的情況下,它能同時與兩個操縱子結(jié)

5、合從而形成DNA環(huán),以此來調(diào)控啟動子的轉(zhuǎn)錄。另外一種是含rRNA rrnB P1啟動子序列和一個位于核心啟動子-10區(qū)下游的lacO操縱子的嵌合啟動子,以此作為對照比較DNA環(huán)的調(diào)控作用。分別以這兩個啟動子為基礎(chǔ)構(gòu)建了不同的表達載體pRNP2和pRNP1.以本實驗室克隆得到的β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因cel5G作為報告基因,驗證兩種嵌合啟動子的調(diào)控效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有一個lacO操縱子的嵌合啟動子在沒有誘導(dǎo)物(IPTG)的情況下已有很高

6、的本底表達,而有兩個lacO操縱子的嵌合啟動子在沒有誘導(dǎo)物存在的時候幾乎沒有表達外源蛋白,當加入IPTG后,外源基因可以很好地表達。另外還利用解淀粉芽孢桿菌FZB42的解淀粉芽孢桿菌核糖核酸酶barnase基因構(gòu)建了pRNP2-barnase重組表達載體,再次驗證了pRNP2載體在BL21(DE3)宿主菌中的嚴謹性.結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了基于rrnB P1啟動子和DNA環(huán)調(diào)控元件的可控表達載體,此載體可以利用多種大腸桿菌作為宿主菌表達外

7、源基因,并且在BL21(DE3)中的嚴謹性最佳,這對于表達有毒蛋白非常有用。
　　 同時根據(jù)載體的特性擴展了該表達載體在定向突變方面的應(yīng)用.采用易錯PCR體外定向進化技術(shù),利用表達載體pRBB建立了來源于Flavobacterium sp.的去除信號肽的乙基對硫磷水解酶基因opd突變體庫,并通過回復(fù)突變研究了突變位點與Oph結(jié)構(gòu)間的關(guān)系.采用pRBB載體,PCR產(chǎn)物可直接與表達載體連接,進行目的基因的表達,省去了亞克隆的步驟,使

8、篩選工作更加簡便、快速.為了分析不同氨基酸位點對乙基對硫磷水解酶活性的影響,我們選取了2個活性喪失的突變體,每個突變體分別有3個不同的氨基酸突變位點,通過對酶分子結(jié)構(gòu)的分析,發(fā)現(xiàn)大部分突變位點氨基酸殘基位于結(jié)構(gòu)表面且遠離活性中心.
　　 通過重疊延伸PCR法分別構(gòu)建了12種單位點和雙位點回復(fù)突變酶。通過檢測突變酶的活性發(fā)現(xiàn),F216L和M293V的單個位點突變對乙基對硫磷水解酶活性沒有影響,而當兩個位點同時突變時酶活降低了50％

9、。這一現(xiàn)象表明,在突變酶F216L和M293V中可能存在兩個突變位點的協(xié)同疊加作用而降低了酶的催化效率,而不是單個氨基酸殘基突變產(chǎn)生的作用。V316E的突變使酶活降低了約70％；E115G和R275H的單位點突變都使得酶活降低了近80％；198T的單突變以及R275H和V316E的雙位點突變都使得酶活全部喪失。這些結(jié)果也揭示了處于非活性中心或非結(jié)合位點的突變位點可能通過改變整個酶分子的空間位阻、催化殘基之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)形成來改變酶的催化特