基于DNA環(huán)調(diào)控的rrnB P1嵌合啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、表達(dá)載體的構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)的關(guān)鍵步驟,而作為表達(dá)載體組成元件之一的啟動(dòng)子是非常重要的。理想的啟動(dòng)子應(yīng)具有以下特性:作用強(qiáng),嚴(yán)格調(diào)控,易轉(zhuǎn)導(dǎo)入其他E.coli以便篩選大量的用于生產(chǎn)蛋白的菌株,而且對(duì)其誘導(dǎo)是簡便和廉價(jià)的.在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,大部分表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制目的基因的表達(dá).誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能控制基因在特定時(shí)期、特定部位表達(dá),這既避免了目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞生長的影響,又可減少菌體蛋白酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解。目前在

2、外源基因表達(dá)中使用的大部分大腸桿菌啟動(dòng)子均來自相應(yīng)操縱元,它們都帶有可與阻遏蛋白特異性結(jié)合的操縱子區(qū)域。
　　 來源于大腸桿菌且有著超強(qiáng)能力的rRNA P1啟動(dòng)子是由包括-10區(qū)和-35區(qū)的核心啟動(dòng)子、一個(gè)順式作用元件(UP元件)和3到5個(gè)反式作用轉(zhuǎn)錄因子(Fis)的結(jié)合位點(diǎn)組成的,但它們?nèi)晕幢挥糜贓.coli進(jìn)行高水平表達(dá),其主要原因是難以對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。本研究的意義就在于通過可行的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)rRNA P1啟動(dòng)子的調(diào)控.

3、　　 本文首先利用大腸桿菌阿拉伯糖操縱元通過DNA環(huán)實(shí)現(xiàn)調(diào)控轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn),應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建嵌合啟動(dòng)子.以此啟動(dòng)子為基礎(chǔ)構(gòu)建了表達(dá)載體pRBB。以β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因cel5G作為報(bào)告基因證實(shí)該重組表達(dá)載體可以接近pET系列商業(yè)化載體的效率進(jìn)行表達(dá).但宿主菌中的AraC調(diào)節(jié)蛋白不足以抑制啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,因此,另外構(gòu)建了調(diào)節(jié)基因araC的重組質(zhì)粒,通過雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)了對(duì)啟動(dòng)子的調(diào)控.
　　 同一宿主菌中的不相容性雙質(zhì)粒

4、在傳代中存在著分配上的不均一性,這在一定程度上影響了表達(dá)的穩(wěn)定性.為了消除這一影響,同時(shí)為了更進(jìn)一步驗(yàn)證DNA環(huán)的調(diào)控作用,我們利用大腸桿菌乳糖操縱元調(diào)控轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn),應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建兩種嵌合啟動(dòng)子.其中一種是含rRNA rrnB P1啟動(dòng)子序列和兩個(gè)lacO操縱子的嵌合啟動(dòng)子,分別位于核心啟動(dòng)子-10區(qū)下游和Fis結(jié)合位點(diǎn)上游,且兩個(gè)lacO操縱子之間的距離是92 bp,當(dāng)有阻遏蛋白(LacⅠ)存在的情況下,它能同時(shí)與兩個(gè)操縱子結(jié)

5、合從而形成DNA環(huán),以此來調(diào)控啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。另外一種是含rRNA rrnB P1啟動(dòng)子序列和一個(gè)位于核心啟動(dòng)子-10區(qū)下游的lacO操縱子的嵌合啟動(dòng)子,以此作為對(duì)照比較DNA環(huán)的調(diào)控作用。分別以這兩個(gè)啟動(dòng)子為基礎(chǔ)構(gòu)建了不同的表達(dá)載體pRNP2和pRNP1.以本實(shí)驗(yàn)室克隆得到的β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因cel5G作為報(bào)告基因,驗(yàn)證兩種嵌合啟動(dòng)子的調(diào)控效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)lacO操縱子的嵌合啟動(dòng)子在沒有誘導(dǎo)物(IPTG)的情況下已有很高

6、的本底表達(dá),而有兩個(gè)lacO操縱子的嵌合啟動(dòng)子在沒有誘導(dǎo)物存在的時(shí)候幾乎沒有表達(dá)外源蛋白,當(dāng)加入IPTG后,外源基因可以很好地表達(dá)。另外還利用解淀粉芽孢桿菌FZB42的解淀粉芽孢桿菌核糖核酸酶barnase基因構(gòu)建了pRNP2-barnase重組表達(dá)載體,再次驗(yàn)證了pRNP2載體在BL21(DE3)宿主菌中的嚴(yán)謹(jǐn)性.結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了基于rrnB P1啟動(dòng)子和DNA環(huán)調(diào)控元件的可控表達(dá)載體,此載體可以利用多種大腸桿菌作為宿主菌表達(dá)外

7、源基因,并且在BL21(DE3)中的嚴(yán)謹(jǐn)性最佳,這對(duì)于表達(dá)有毒蛋白非常有用。
　　 同時(shí)根據(jù)載體的特性擴(kuò)展了該表達(dá)載體在定向突變方面的應(yīng)用.采用易錯(cuò)PCR體外定向進(jìn)化技術(shù),利用表達(dá)載體pRBB建立了來源于Flavobacterium sp.的去除信號(hào)肽的乙基對(duì)硫磷水解酶基因opd突變體庫,并通過回復(fù)突變研究了突變位點(diǎn)與Oph結(jié)構(gòu)間的關(guān)系.采用pRBB載體,PCR產(chǎn)物可直接與表達(dá)載體連接,進(jìn)行目的基因的表達(dá),省去了亞克隆的步驟,使

8、篩選工作更加簡便、快速.為了分析不同氨基酸位點(diǎn)對(duì)乙基對(duì)硫磷水解酶活性的影響,我們選取了2個(gè)活性喪失的突變體,每個(gè)突變體分別有3個(gè)不同的氨基酸突變位點(diǎn),通過對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)的分析,發(fā)現(xiàn)大部分突變位點(diǎn)氨基酸殘基位于結(jié)構(gòu)表面且遠(yuǎn)離活性中心.
　　 通過重疊延伸PCR法分別構(gòu)建了12種單位點(diǎn)和雙位點(diǎn)回復(fù)突變酶。通過檢測(cè)突變酶的活性發(fā)現(xiàn),F216L和M293V的單個(gè)位點(diǎn)突變對(duì)乙基對(duì)硫磷水解酶活性沒有影響,而當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)酶活降低了50％

9、。這一現(xiàn)象表明,在突變酶F216L和M293V中可能存在兩個(gè)突變位點(diǎn)的協(xié)同疊加作用而降低了酶的催化效率,而不是單個(gè)氨基酸殘基突變產(chǎn)生的作用。V316E的突變使酶活降低了約70％；E115G和R275H的單位點(diǎn)突變都使得酶活降低了近80％；198T的單突變以及R275H和V316E的雙位點(diǎn)突變都使得酶活全部喪失。這些結(jié)果也揭示了處于非活性中心或非結(jié)合位點(diǎn)的突變位點(diǎn)可能通過改變整個(gè)酶分子的空間位阻、催化殘基之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)形成來改變酶的催化特