棉花arf1啟動(dòng)子表達(dá)的特異性研究.pdf

1、Bt抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。殺蟲(chóng)基因在植物體內(nèi)定時(shí)、定量和定點(diǎn)表達(dá)來(lái)增強(qiáng)抗蟲(chóng)效果，這是第二、三代植物抗蟲(chóng)基因工程研究及生物安全所關(guān)注的重要內(nèi)容。啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵性作用，它在很大程度上決定目的基因表達(dá)的時(shí)間、空間和強(qiáng)度。目前，植物基因工程廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，它們驅(qū)動(dòng)外源基因在植物各種組織和所有發(fā)育階段表達(dá)，這無(wú)疑增加了植物的代謝負(fù)擔(dān)，并造成物質(zhì)和能量的浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物形態(tài)發(fā)生改變，甚至影響植物生長(zhǎng)

2、發(fā)育。因此，本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離到的棉花ADP-ribosylationfactor1(arf1)基因啟動(dòng)子的功能進(jìn)行鑒定，嘗試在棉花抗蟲(chóng)基因工程研究中應(yīng)用。 本研究所構(gòu)建的植物表達(dá)載體pGBI121.A1Bt(A)攜帶棉花aft1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)cry1A基因的表達(dá)盒；植物表達(dá)載體pGBI35SBtA1Bt(B)含有兩個(gè)cry1A基因的表達(dá)盒，分別由CaMV35S啟動(dòng)子和棉花arf1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。對(duì)照載體pGBI121.4AB(CK)

3、攜帶CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)cry1A基因的表達(dá)盒。 將A、B及CK三個(gè)植物表達(dá)載體利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別導(dǎo)入煙草，經(jīng)過(guò)卡那霉素篩選，最終得到再生植株231株。轉(zhuǎn)對(duì)照載體的煙草再生植株為68株，載體A的煙草再生植株為61株，載體B的煙草再生植株為102株。利用ELISA方法對(duì)陽(yáng)性植株不同部位進(jìn)行Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白表達(dá)量測(cè)定。在煙草的蒴果中，A系的表達(dá)量是CK系的1.5倍，B系的表達(dá)量是CK系的2.4倍；在煙草的蒴果殼中，A系的表

4、達(dá)量是CK系的1.5倍，B系的表達(dá)量是CK系的1.9倍；在煙草的花瓣中，A系的表達(dá)量是CK系的1.4倍，B系的表達(dá)量是CK系的1.5倍；在煙草的葉中，A系的表達(dá)量是CK系的0.3倍，B系的表達(dá)量是CK系的1.4倍。結(jié)果表明arf1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源殺蟲(chóng)基因在煙草的蒴果、蒴果殼、花瓣中的表達(dá)比對(duì)照CaMV35S有顯著提高，而在葉中較低。并且發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)啟動(dòng)子在功能上可疊加。 進(jìn)一步將上述三種植物表達(dá)載體用花粉管通道法導(dǎo)入陸地棉品種Y18

5、和P13中，共獲得T0代種子的重量分別為456.89g和2468.58g。在Y18中通過(guò)卡那霉素進(jìn)行篩選和PCR鑒定，得到轉(zhuǎn)對(duì)照載體的CK系轉(zhuǎn)基因植株10株，A系4株，B系3株；在P13中獲得A系轉(zhuǎn)基因植株19株，B系8株。并用ELISA方法對(duì)陽(yáng)性植株幼蕾及葉中殺蟲(chóng)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了初步檢測(cè)，結(jié)果表明，不同植物表達(dá)載體的殺蟲(chóng)基因在棉花中的表達(dá)情況比較復(fù)雜，與煙草中的情況不完全一致，但數(shù)據(jù)清晰表明由arf1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)殺蟲(chóng)基因表達(dá)的A轉(zhuǎn)基因株