調(diào)控鴨胚胎早期發(fā)育及后期強(qiáng)弱關(guān)鍵基因的篩選與鑒定.pdf

1、孵化率是家禽的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一。與雞的人工孵化率相比(81～85％)，種鴨受精蛋的孵化率較低(65～82％)，其影響因素主要包括種禽日齡、蛋的大小和蛋的污染程度等。目前，對(duì)禽類孵化率的研究多集中在遺傳背景、種蛋品質(zhì)和孵化條件等方面，其分子調(diào)控機(jī)制的研究甚少。禽類胚胎發(fā)育的早期和后期是影響孵化率的兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，因此本論文旨在通過對(duì)這兩個(gè)時(shí)期鴨胚發(fā)育差異表達(dá)基因或蛋白的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式進(jìn)行研究，以期初步了解胚胎發(fā)育的分子機(jī)制，并為分子標(biāo)記輔助

2、育種，提高胚胎孵化率提供理論基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)一:分別采集鴨上一個(gè)蛋產(chǎn)出后6h（卵裂期）和25h（明區(qū)形成期）的胚盤作為驅(qū)動(dòng)組和實(shí)驗(yàn)組，采用DSN酶介導(dǎo)的均一化消減雜交方法(DSNH)，建立了鴨早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因的消減文庫(kù)，并對(duì)篩選獲得的關(guān)鍵基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)驗(yàn)證。結(jié)果隨機(jī)挑選216個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得了66條差異表達(dá)序列，通過BLASTX比對(duì)，39個(gè)基因可注釋到已知蛋白上。GeneOntology(GO)

3、功能分類結(jié)果表明，差異基因分別與代謝、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)、增殖/凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附和甲基化等生物過程或功能相關(guān)。此外，獲得了編碼302個(gè)氨基酸的Nanog基因cDNA序列全長(zhǎng)，與其他物種相似，保守區(qū)為63氨基酸組成的同源結(jié)構(gòu)域，是Nanog蛋白發(fā)揮功能的核心區(qū)。對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在上一個(gè)蛋產(chǎn)出6h的胚盤中未檢測(cè)到Nanog基因表達(dá)，20h有少量表達(dá)，25h較高表達(dá)(P＜0.05)。HSP90AA1在20h和25h胚盤中

4、的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。DEKmRNA在6h和20h胚盤中表達(dá)水平接近(P＞0.05)，而在25h表達(dá)極顯著升高（P＜0.05）。EIF2AK3、DNMT3B、RCP三個(gè)基因在25h的胚盤中表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），與建庫(kù)結(jié)果一致。
　　實(shí)驗(yàn)二:應(yīng)用基于新一代高通量測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）結(jié)合生物信息學(xué)方法，分析了兩組樣本在轉(zhuǎn)錄組水平所有基因表達(dá)的差異。結(jié)果表明，正常出殼和輔助出殼組分別獲得77，572，048和

5、79，921，784原始reads，去除冗余、低質(zhì)量的reads以及接頭序列后，分別得到73，975，798和77，977，436cleanreads，用Trinity軟件將其拼接，最終獲得盡可能長(zhǎng)的拼接轉(zhuǎn)錄本(unigenes)。對(duì)兩組拼接數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，≥200bp的unigene分別有159，083和161，804個(gè)，平均長(zhǎng)度為862bp和1206bp，N50的長(zhǎng)度分別為1769和3059bp。兩組拼接的所有非冗余序列用BLASTX

6、軟件與NCBINr和Swiss-Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)與注釋，74,045unigenes可以匹配到20，840個(gè)已知蛋白上。選擇P＜0.005、FDR≤0.001且差異大于2倍的基因?yàn)轱@著差異表達(dá)基因，結(jié)果獲得注釋的差異表達(dá)基因1629個(gè)，輔助與正常出殼組相比，510個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1119個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。輔助出殼鴨肝臟中，與能量代謝相關(guān)的基因G6PC和ATP5A1表達(dá)上調(diào)，而參與免疫防御作用的關(guān)鍵基因GSTA1、GAL9、MH

7、CⅠ和MHCⅡ表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)一步的qPCR檢測(cè)顯示，ATP5A1、ATP7B、FEZ2、MHCⅠ和MHCⅡ5個(gè)基因的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。此外，對(duì)轉(zhuǎn)錄組SSR標(biāo)記分析表明，SSR標(biāo)記重復(fù)類型以完全型為主，其中三核苷重復(fù)類型數(shù)目最多，其次是二核苷酸。不完全型中僅有二核和三核苷酸兩種重復(fù)類型。
　　實(shí)驗(yàn)三:應(yīng)用iTRAQ技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定與生物信息學(xué)方法，初步分析了輔助與正常出殼鴨肝臟蛋白質(zhì)組的差異。結(jié)果鑒定出143個(gè)表達(dá)差異

8、蛋白，與正常出殼組相比，輔助出殼組有78個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，65個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。GO注釋和Pathway富集分析表明，這些蛋白主要是與糖代謝、氧氣運(yùn)輸、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞骨架以及氧化還原代謝等生物過程或功能相關(guān)。輔助出殼組糖酵解通路中的4種酶（ALDOB、G3P1、PGK和ENO）和細(xì)胞呼吸通路中的3種酶(ACOC、CYC和NDUA4)表達(dá)均顯著上調(diào);參與氧氣運(yùn)輸?shù)?種血紅蛋白（HBAD、HBA和HBE）和應(yīng)激保護(hù)的3種熱休克蛋白（HSP60、

9、HSP10和GRP78）表達(dá)均顯著下調(diào)。利用qPCR檢測(cè)ACO1、ALDOB、G3P1和SPA8基因在mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果表明在輔助出殼鴨肝臟中，ACO1mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，ALDOB、G3P1和HSPA8mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），部分基因的mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)模式不一致。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明，HSPD1、G3P1、PGK1是最核心的蛋白，提示它們?cè)邙喬グl(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　本研