異嗜性鼠白血病病毒相關(guān)病毒核酸及抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、異嗜性鼠白血病病毒相關(guān)病毒核酸及抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用研究
　　 本文針對(duì)目前異嗜性鼠白血病病毒相關(guān)病毒(Xenotropic murine leukaemia virus-related virus，XMRV)研究的熱點(diǎn)——臨床樣本中是否存在XMRV（包括核酸和抗體）的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立進(jìn)行了探討，共由兩部分研究組成。
　　 XMRV最先于2006年在RNase L基因缺陷型的前列腺癌組織中發(fā)現(xiàn)，其序列約8.200

2、 bp，與鼠白血病病毒(Murine leukemia virus. MLV)的同源性達(dá)到近95％。2009年美國(guó)惠特莫爾·彼得森(Whittemore Peterson Institute, WPI)神經(jīng)免疫疾炳研究所的Lombarai等的研宄表明，XMRV與慢性疲勞綜合癥(Chronic fatiguesyndrome，CFS)患者密切相關(guān)，但其后世界各地的眾多研究者均未能重現(xiàn)該結(jié)果。XMRV與人類疾病之間是否具有相關(guān)性尚不清楚，因

3、此建立具有高靈敏和特異性的XMRV核酸和抗體的檢測(cè)方法勢(shì)在必行，從而為XMRV是否致病的研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)。
　　 在第一部分中，我們首先建立了避免XMRV核酸漏檢的多重?zé)晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)(Ploymerase chain reaction. PCR)/逆轉(zhuǎn)錄(Reverse transcription. RT)-PCR測(cè)定方法，并對(duì)CFS患者進(jìn)行檢測(cè)，探討XMRV與CFS疾病是否具有相關(guān)性。本研究采用重疊PCR(O

4、verlap PCR)技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC-MS2-2V和pACYC-MS2-IC-2V作為XMRV DNA質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)。利用MS2噬菌體蛋白質(zhì)和基因組RNA相互作用的機(jī)制及噬菌體衣殼蛋白空間構(gòu)象的特點(diǎn)進(jìn)行噬菌體顆粒的包裝，將pACYC-MS2-2V和pACYC-MS2-IC-2V分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，超聲碎菌后，離心收集上清，上清中分別含己表達(dá)出的XMRV RNA的病毒樣顆粒(Virus-like partic

5、les. VLPs)標(biāo)準(zhǔn)品(VLPs-standard)和內(nèi)標(biāo)VLPs(VLPs internalcontrol, VLPs-IC)。在上清中加入DNase I和RNase A,37℃過(guò)夜消化，以去除其中的DNA和RNA，并用分子篩色譜層析純化VLPs。我們?cè)趐ACYC-MS2-2V和pACYC-MS2-IC-2V嵌合體序列中加入HCV5'-UTR序列，可以用HCV RNA的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)VLPs內(nèi)的嵌合體RNA，從而解決了其無(wú)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)

6、品RNA病毒的量值溯源問(wèn)題，并實(shí)現(xiàn)對(duì)VLPs的定量。以定量的XMRV DNA/VLPs作為質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)建立多重?zé)晒舛縋CR/RT-PCR檢測(cè)體系，并應(yīng)用該檢測(cè)體系對(duì)CFS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)及血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示我們建立的多重?zé)晒舛縋CR/RT-PCR柃測(cè)體系的靈敏度可達(dá)到20copies/反應(yīng)/10 IU/mL，其特異性均可以達(dá)到100％，批

7、內(nèi)和批間的變異系數(shù)分別為1.76%-2.80％/1.70%-2.59%和1.07%-2.56%/1.06%-2.74％CFS患者PBMC及血清中均未檢測(cè)到XMRV，說(shuō)明XMRV與CFS之間無(wú)相關(guān)性。以上結(jié)果表明，我們成功建立了避免XMRV核酸漏檢的多重?zé)晒舛縋CR/RT-PCR測(cè)定方法，其優(yōu)點(diǎn)包括可最大限度的避免XMRV的漏檢；所制備的內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定、對(duì)人安全、耐DNase和RNase，可有效防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠：應(yīng)用該

8、檢測(cè)方法對(duì)CFS患者進(jìn)行檢測(cè)得到的陰性結(jié)果，進(jìn)一步豐富了XMRV在CFS中的研究?jī)?nèi)容，具有一定的臨床價(jià)值和科學(xué)意義。
　　 在第二部分中，建立雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Fnzvme-linkedimmunosorbent assav，ELISA)方法應(yīng)用于血清抗XMRV-包膜蛋白(Env)-gp70，跨膜蛋白(TM)-p15E及gag衣殼蛋白(CA)-p30蛋白抗體的檢測(cè),并用該方法測(cè)定免疫功能障礙患者血清中上述抗體的分布情況

9、，了解它們與疾病是否具有相關(guān)性。本研究采用PCR方法分別擴(kuò)增XMRV-p70、 p15E、p30編碼的核苷酸序列，并將其分別克隆入原核表達(dá)載體pET16b及pET16b-Eseb，獲得原核重組表達(dá)載體pET16b-gp70/p15E、pET16b-Eseb-p30，在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，通過(guò)包涵體分離和Ni2+親和層析純化得到了gp70、p15E、p30目的蛋白。選取新西蘭大白兔(2kg)分別制備兔抗gp70、p15E、p30蛋

10、白多克隆抗體，并純化和驗(yàn)證。最后建立雙抗原夾心ELISA方法檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE.)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)性硬化癥(Progressivesystemic sclerosis.pSS)和結(jié)核(Tuberculosis.TB)以及正常人血清中抗gp70、p15E、p30抗體的分布情況，同時(shí)采用免疫印跡方法(Western bl