J亞群禽白血病病毒gp85基因的克隆表達(dá)及初步應(yīng)用.pdf

1、禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的雞的各種可傳播的良性和惡性腫瘤。J亞群禽白血病病毒(ALV-J)是90年代初期分離并鑒定的一個新的亞群，其傳播性和致病性都比其他亞群強(qiáng)，可引起雞的髓細(xì)胞瘤，給全球養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，國內(nèi)部分省市出現(xiàn)大規(guī)模的禽白血病感染病例，主要以J亞群病毒感染為主。病毒的gp85基因是J亞群區(qū)別其它亞群的特異性序列。本研

2、究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ALV-Jgp85蛋白，建立J亞群禽白血病ELISA抗體檢測方法，利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)制備抗gp85蛋白的單克隆抗體。為我國J亞群禽白血病的血清監(jiān)測和抗原診斷試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
　　 (1)根據(jù)GeneBank中ALV-J的gp85基因序列設(shè)計針對J亞群病毒的特異性引物，以本實驗室保存的ALV-J XT0908毒株為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增目的片段，測序結(jié)果顯示gp85基因片段與G

3、eneBank中部分ALV-J核苷酸序列同源性在93.6%-98.2%。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-gp85，表達(dá)目的蛋白，使用His-鎳親和層析柱進(jìn)行純化。
　　 (2)用gp85蛋白作為包被抗原，建立J亞群禽白血病ELISA抗體檢測方法，并對該方法進(jìn)行評價。結(jié)果表明該檢測方法重復(fù)性良好，與禽源的幾種病毒和細(xì)菌陽性血清均無交叉反應(yīng)，并利用建立的ELISA抗體檢測方法對臨床血清樣品進(jìn)行檢測，與IDEXX公司生產(chǎn)的抗體檢測試

4、劑盒符合率達(dá)到96.29%。
　　 (3)用gp85蛋白免疫Balb/C小鼠，將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞進(jìn)行融合，陽性孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，并對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔制備腹水。用辛酸.硫酸銨沉淀法對腹水進(jìn)行純化。結(jié)果表明，獲得5株雜交瘤細(xì)胞：1G4、1B9、3A1、3D12、5G5。雜交瘤細(xì)胞上清抗體效價均在27以上，腹水抗體效價均在100×27以上，染色體數(shù)目均在79-93之間。Wester