禽白血病病毒J亞群、B亞群的分離鑒定及核酸探針的制備.pdf

1、禽白血?。ˋvian Leukosis，AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱。禽白血病病毒群分為A、B、C、D、E、J等共10亞群。近年來，J亞群禽白血病在我國呈流行性爆發(fā)，對我國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，國內(nèi)外尚無有效的疫苗和藥物用于防治本病。世界各國控制禽白血病的主要措施是通過病原檢測，淘汰陽性雞，從而凈化種群消滅本病。但由于禽白血病毒gp85基因極易發(fā)生抗原變動，現(xiàn)有ALV抗體檢測試劑盒不能保證檢

2、測到所有中國株ALV抗體。基于此，建立適合我國ALV感染的快速診斷方法顯得尤為必要。
　　 本實驗通過血清學(xué)ELISA、病理學(xué)以及病毒分離，獲得ALV-B和ALV-J各兩株分離株，并在國內(nèi)首次從感染ALV-J的海藍白商品蛋雞群中分離到B亞群禽白血病病毒（ALV-B），同時證實了ALV-B、ALV-J在同一雞只體內(nèi)的混合感染。對該雞場血清樣品（92份）ELISA檢測顯示：ALV-A/B型抗體陽性率為16.3％，ALV-J抗體陽性率

3、為13％，其中有1只雞呈現(xiàn)抗體雙陽性；病理組織學(xué)觀察顯示，在肝臟同一位置發(fā)現(xiàn)淋巴細胞樣瘤細胞和髓細胞樣瘤細胞增生灶，其它組織器官（除腦、神經(jīng)和法氏囊）也有不同程度的兩種瘤細胞增生；合成ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV和REV的特異性引物進行PCR檢測，獲得1100bp的ALV-B特異性片段和924bp的ALV-J特異性片段，而MDV和REV檢測為陰性。在同一只雞中出現(xiàn)ALV-B和ALV-J雙陽性，分離得到ALV-B和ALV-J

4、各兩毒株；對ALV-B、ALV-J擴增序列進行遺傳進化樹分析表明，兩ALV-B分離株與其代表株的同源性分別為92.8％和93.0％；兩ALV-J分離株與英國原型株同源性分別為96.9％和91.5％，與美國原型株同源性為85.9％和81.5％，與國內(nèi)分離毒株同源性在87.0％～98.7％之間。
　　 基于ALV群內(nèi)混合感染的出現(xiàn)，制備了通用探針和ALV-J核酸探針，運用斑點雜交方法對禽白血病B、J亞群和馬立克氏病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥進

5、行檢測診斷。根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的ALV各亞群基因的序列，篩選比較各亞群gag基因和env囊膜基因，直接合成核酸探針的目的片段，利用隨機引物法標(biāo)記物地高辛（DIG）制備了ALV通用核酸探針和J亞群核酸探針；通過斑點雜交檢測方法對此探針特異性進行驗證，檢測結(jié)果顯示：該探針能與標(biāo)準(zhǔn)毒株ALV核酸發(fā)生特異性雜交，而與對照的未接毒DNA、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）、馬立克氏病病毒（MDV）核酸雜交反應(yīng)為陰性，具有良好的特異性。特