禽白血病病毒J亞群、B亞群的分離鑒定及核酸探針的制備.pdf

1、禽白血?。ˋvian Leukosis，AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱。禽白血病病毒群分為A、B、C、D、E、J等共10亞群。近年來(lái)，J亞群禽白血病在我國(guó)呈流行性爆發(fā)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有效的疫苗和藥物用于防治本病。世界各國(guó)控制禽白血病的主要措施是通過(guò)病原檢測(cè)，淘汰陽(yáng)性雞，從而凈化種群消滅本病。但由于禽白血病毒gp85基因極易發(fā)生抗原變動(dòng)，現(xiàn)有ALV抗體檢測(cè)試劑盒不能保證檢

2、測(cè)到所有中國(guó)株ALV抗體?；诖耍⑦m合我國(guó)ALV感染的快速診斷方法顯得尤為必要。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血清學(xué)ELISA、病理學(xué)以及病毒分離，獲得ALV-B和ALV-J各兩株分離株，并在國(guó)內(nèi)首次從感染ALV-J的海藍(lán)白商品蛋雞群中分離到B亞群禽白血病病毒（ALV-B），同時(shí)證實(shí)了ALV-B、ALV-J在同一雞只體內(nèi)的混合感染。對(duì)該雞場(chǎng)血清樣品（92份）ELISA檢測(cè)顯示：ALV-A/B型抗體陽(yáng)性率為16.3％，ALV-J抗體陽(yáng)性率

3、為13％，其中有1只雞呈現(xiàn)抗體雙陽(yáng)性；病理組織學(xué)觀察顯示，在肝臟同一位置發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞樣瘤細(xì)胞和髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞增生灶，其它組織器官（除腦、神經(jīng)和法氏囊）也有不同程度的兩種瘤細(xì)胞增生；合成ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV和REV的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得1100bp的ALV-B特異性片段和924bp的ALV-J特異性片段，而MDV和REV檢測(cè)為陰性。在同一只雞中出現(xiàn)ALV-B和ALV-J雙陽(yáng)性，分離得到ALV-B和ALV-J

4、各兩毒株；對(duì)ALV-B、ALV-J擴(kuò)增序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析表明，兩ALV-B分離株與其代表株的同源性分別為92.8％和93.0％；兩ALV-J分離株與英國(guó)原型株同源性分別為96.9％和91.5％，與美國(guó)原型株同源性為85.9％和81.5％，與國(guó)內(nèi)分離毒株同源性在87.0％～98.7％之間。
　　 基于ALV群內(nèi)混合感染的出現(xiàn)，制備了通用探針和ALV-J核酸探針，運(yùn)用斑點(diǎn)雜交方法對(duì)禽白血病B、J亞群和馬立克氏病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥進(jìn)

5、行檢測(cè)診斷。根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的ALV各亞群基因的序列，篩選比較各亞群gag基因和env囊膜基因，直接合成核酸探針的目的片段，利用隨機(jī)引物法標(biāo)記物地高辛（DIG）制備了ALV通用核酸探針和J亞群核酸探針；通過(guò)斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法對(duì)此探針特異性進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果顯示：該探針能與標(biāo)準(zhǔn)毒株ALV核酸發(fā)生特異性雜交，而與對(duì)照的未接毒DNA、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）、馬立克氏病病毒（MDV）核酸雜交反應(yīng)為陰性，具有良好的特異性。特