DNA甲基化與慢性髓細(xì)胞白血病急變的相關(guān)性及慢性髓細(xì)胞白血病動(dòng)物模型的建立.pdf

1、一、DNA甲基化與慢性髓細(xì)胞白血病急變的相關(guān)性
　　 目的：探討慢性髓細(xì)胞白血病急變時(shí)的DNA甲基化程度，以及急變與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶突變的關(guān)聯(lián)性，并觀察去甲基化藥物（地西他濱）對K562細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，為進(jìn)一步研究慢性髓細(xì)胞白血病急變期的甲基化狀態(tài)提供體外研究依據(jù)。
　　 方法：1）、收集就診于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院的四對CML患者骨髓標(biāo)本（即同-患者的慢性期及急變期標(biāo)本），抽提基因組DNA，應(yīng)用MspⅠ和HapⅡ雙

2、酶切檢測其整體甲基化狀態(tài);此外，再收集初診慢性髓細(xì)胞白血病慢性期（15例）及慢性髓細(xì)胞白血病急變期（13例）患者新鮮骨髓標(biāo)本，抽提總mRNA，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平，以缺鐵性貧血（10例）患者骨髓標(biāo)本為對照。2）、整理2003年至2010年就診于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院的慢性髓細(xì)胞白血病實(shí)驗(yàn)室資料，從中篩選出81例CML-BC患者骨髓凍存細(xì)胞和染色體懸液，抽提基因組DNA，行DNMT3A全外顯子測序。3）、將地西他

3、濱按2μmol/L濃度加至對數(shù)生長期K562細(xì)胞，0.4％臺(tái)盼藍(lán)染色后活細(xì)胞計(jì)數(shù)、軟瓊脂培養(yǎng)觀察集落形成能力，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，并分別用QRT-PCR和Westernbloting檢測地西他濱處理前后DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1，DNMT3A，DNMT3B)在mRNA水平和蛋白水平的變化，均以未予以地西他濱處理的K562細(xì)胞為對照。
　　 結(jié)果：1）、MspⅠ和HapⅡ雙酶切提示CML-CP和CML-BC均存在

4、處于高甲基化狀態(tài)，但尚無明顯差異;初治慢性髓細(xì)胞白血病慢性期與急變期相比，急變期DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平高于慢性期患者(P＜0.005)，此外，慢性期及急變慢性髓細(xì)胞白血病DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶水平均高于缺鐵性貧血組患者(P＜0.05)。2)、所檢測的81例慢性髓細(xì)胞白血病急變患者，其基因組DNA未見DNMT3A編碼區(qū)外顯子突變。3)、與未處理組相比，地西他濱處理后K562細(xì)胞的增殖能力下降，細(xì)胞生長抑制率明顯增加，軟瓊脂培養(yǎng)集落形成能力

5、下降，細(xì)胞周期測定其大多細(xì)胞被阻滯在G2/M期，細(xì)胞凋亡率明顯增加，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1，DNMT3A,DNMT3B)在mRNA和蛋白水平上不但無明顯下降，相反，其表達(dá)水平均有不同程度的升高(P＜0.005)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：1）、DNA高甲基化參與了慢性髓細(xì)胞白血病的發(fā)生及急性變過程，但是其機(jī)制與DNMT3A全外顯子突變無相關(guān)性。2）、地西他濱對K562細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡均有影響，可抑制明顯K

6、562細(xì)胞的生長，促進(jìn)凋亡的發(fā)生，但并非通過降低DNMTs的表達(dá)水平發(fā)揮作用，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
　　 二、移植性慢性髓細(xì)胞白血病裸鼠模型建立的初步結(jié)果
　　 目的：慢性髓細(xì)胞白血病(Chronicmyeloidleukemia，CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，CML干細(xì)胞被認(rèn)為是導(dǎo)致疾病發(fā)生、發(fā)展并最終急變的根源，目前尚缺乏穩(wěn)定的動(dòng)物模型證明CML干細(xì)胞的存在。本文旨在通過建立慢性髓細(xì)胞白血病裸

7、鼠模型，探討人慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞在Babl/c裸小鼠體內(nèi)的生物學(xué)行為，并使CML干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)富集成為可能。
　　 方法：對4至6周齡的BALB/c裸鼠進(jìn)行切脾(splenectomy)，環(huán)磷酰胺腹腔注射（cytoxanintraperitonealinjection）及全身亞致死劑量輻照（sublethalirradiation）等預(yù)處理(SCI)后，經(jīng)尾靜脈接種(5-8)×107個(gè)人慢性髓細(xì)胞白血病慢性期患者單個(gè)核細(xì)胞。

8、對4至6周齡的BALB/c裸鼠進(jìn)行全身致死劑量輻照(lethalirradiation)后，經(jīng)尾靜脈接種5×106同源裸鼠骨髓細(xì)胞+(5-8)×107個(gè)人慢性髓粒細(xì)胞白血病慢性期患者單個(gè)核細(xì)胞。應(yīng)用RT-PCR、塑膠包埋病理切片以及流式細(xì)胞術(shù)等檢測裸鼠各臟器及骨髓中人CML細(xì)胞浸潤情況。
　　 結(jié)果：CML細(xì)胞能浸潤至經(jīng)SCI預(yù)處理的裸鼠骨髓體內(nèi)，但目前成功率還很低，僅為通過Babl/c裸鼠建立人CML動(dòng)物模型的一個(gè)開端。