HBV和HIV假病毒載體系統(tǒng)的初步研究.pdf

1、治療乙肝、艾滋病仍然是棘手的問題，本研究試圖將乙肝病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)和人類免疫缺陷病毒(Human immlmodeficiency virus，HIV)改造為基因治療載體，主要進(jìn)行了以下研究工作： 乙肝感染性克隆的構(gòu)建我們利用酶切的方法將含有乙肝病毒adw2亞型全長HBV DNA的質(zhì)粒分別克隆到載體pUC19和pCDNA3.1上，分別獲得pUV-HBVxm(含有1.6倍乙肝病毒基因組)和pCDNA

2、-HBVxm(含有1.4倍乙肝病毒基因組)。這兩種質(zhì)?？梢栽贖BV啟動(dòng)子引導(dǎo)下合成全長的genomic RNA，理論上可以生成病毒顆粒。用脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM>2000將上述兩種感染性克隆分別轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，用ELISA方法檢測到細(xì)胞培養(yǎng)上清有抗原表達(dá)。上述研究為本課題下一步的研究設(shè)立陽性對(duì)照。 HBV假病毒包裝系統(tǒng)的建立以質(zhì)粒pUV-HBVxm為基礎(chǔ)通過分步酶切的方法，僅刪除包裝信號(hào)區(qū)基因序

3、列，保留X、C、P、S編碼基因，從而獲得可以表達(dá)HBV全部蛋白但不能包裝的輔助質(zhì)粒HelperHBV。構(gòu)建的輔助載體HelperHBV轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，通過G418加壓篩選，ELISA方法檢測培養(yǎng)液上清HBsAg和HBeAg，篩選到穩(wěn)定高表達(dá)HBsAg和HBeAg的細(xì)胞克隆2株。 HBV假病毒載體的構(gòu)建利用基于PCR技術(shù)的定點(diǎn)突變引入移碼突變或無義突變，分別破壞X、C、P區(qū)開放讀碼框，并且以egfp替代S區(qū)基因構(gòu)建

4、了載體PseudoHBV。該載體含有1.4倍乙肝病毒基因組，其中包括包裝信號(hào)序列和一些HBV順式作用元件如啟動(dòng)子和多腺苷酸化位點(diǎn)，因此在特定條件下它能包裝和復(fù)制并且產(chǎn)生全長3.2kb的假病毒，該假病毒包含報(bào)告基因egfp和突變的乙肝病毒基因組。假病毒載體PseudoHBV轉(zhuǎn)染上述包裝細(xì)胞系后，24h可以觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。該載體和輔助載體HelperHBV共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，用G418加壓篩選同樣獲得既能穩(wěn)定表達(dá)HBsAg和HB

5、eAg又能表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞株12株。 HBV假病毒檢測及分析通過電鏡觀察病毒顆粒、定量PCR(quantitativePCR)等一系列檢測方法對(duì)假病毒進(jìn)行了定性、定量分析。電鏡觀察穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆的培養(yǎng)上清有直徑約42nm的病毒顆粒存在，為了進(jìn)一步分析假病毒的產(chǎn)生效率，我們建立了實(shí)時(shí)PCR(Real-time PCR)方法檢測假病毒和含量，細(xì)胞系培養(yǎng)上清中假病毒量約為10<'3>拷貝/μl，輔助細(xì)胞系培養(yǎng)上清中未檢測到病毒

6、。 HIV-1假型病毒載體的構(gòu)建將“假病毒治療真病毒”的思路應(yīng)用于治療艾滋病(Acquired immtlne deficiency syndrome，AIDS)的研究，通過改造HIV標(biāo)準(zhǔn)株質(zhì)粒NL4-3，用綠色熒光蛋白基因egfp替代部分env基因(保留和其重疊的vpu及rre)，得到EGFP重組慢病毒載體NL4-3-EGFP。用水皰性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G)包裝該重組病毒基因組，可形成假型病毒。將NL4-3-EGFP和