慢病毒基因載體系統(tǒng)的拓展應(yīng)用性研究.pdf

1、慢病毒載體因?yàn)榫哂心芨腥痉至押臀捶至训乃拗骷?xì)胞,并且?guī)Ыo宿主細(xì)胞輕微的免疫原性的優(yōu)點(diǎn),而在轉(zhuǎn)基因改造、基因功能分析和基因治療中得到了廣泛的應(yīng)用。但是,慢病毒載體的整合特性,尤其是它整合到基因組的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域或鄰近活性區(qū)域的特性,使基因功能分析的結(jié)果產(chǎn)生未知干擾,并給實(shí)際應(yīng)用帶來風(fēng)險(xiǎn)。慢病毒的整合可能會(huì)引起突變,或者改變非目的基因的表達(dá)從而對目的基因的功能研究產(chǎn)生影響,而且病毒序列整合到宿主細(xì)胞基因組中可能會(huì)在轉(zhuǎn)基因操作中帶來長期和有害的

2、影響。我們的研究旨在利用慢病毒的優(yōu)良特性的同時(shí),通過其他的改進(jìn)措施來解決慢病毒整合帶來的消極影響,拓展慢病毒的應(yīng)用性。
　　 為了避免插入突變的風(fēng)險(xiǎn),我們對慢病毒包裝系統(tǒng)的pMDLg/pRRE載體上的整合酶中的5個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)錯(cuò)義突變,并對慢病毒載體相關(guān)部件和包裝技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化。獲得了IDLV-D64A、IDLV-D116A、IDIN-R262A-R263AK264H、IDLN-D64A-D116A、IDLV-D64A-D1

3、16A-R262A-R263A-K264H五種整合酶缺陷的慢病毒,通過對這5種慢病毒的包裝效率、整合酶缺陷慢病毒所介導(dǎo)的外源基因表達(dá)能力、殘留整合酶活性、整合缺陷形成的2LTR與慢病毒基因組的比率以及介導(dǎo)外源基因表達(dá)能力的持續(xù)性的比較,綜合分析其應(yīng)用的可行性和安全性。我們發(fā)現(xiàn)整合酶上這些位點(diǎn)的突變并沒有協(xié)同效應(yīng)或相加效應(yīng),而IDLV-D64A病毒可有效用于基因功能分析和基因治療。
　　 目前,對于小鼠等少數(shù)胚胎干細(xì)胞技術(shù)成熟的模

4、式動(dòng)物,可以通過同源重組技術(shù)獲得穩(wěn)定的基因改造;對于多數(shù)的其他動(dòng)物,還需要依賴慢病毒整合來獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,需要利用Cre酶切除整入基因組的病毒序列殘存來消除轉(zhuǎn)基因的安全隱患。Cre酶定位切除還在小鼠的條件性基因敲除中廣泛應(yīng)用。為了對Cre酶的表達(dá)和發(fā)揮功能的情況進(jìn)行定位和監(jiān)視,我們構(gòu)建了由CMV驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶和熒光蛋白聯(lián)合表達(dá)的慢病毒載體。該載體中Cre重組酶與綠色/紅色熒光蛋白通過口蹄疫病毒的2A序列藕聯(lián),我們發(fā)

5、現(xiàn)這種改建不影響病毒的包裝和感染以及Cre的功能活性,而熒光報(bào)告卻精準(zhǔn)有效。在載體病毒中我們還引入了突變型LoxP中重組活性很高的位點(diǎn)Lox5171,將兩組LoxP位點(diǎn)同向置于一個(gè)慢病毒載體中,借助Cre酶的剪切能將殘留病毒片段最小化。這些改建提供了利用慢病毒整合獲得安全轉(zhuǎn)基因的改進(jìn)方案。
　　 有報(bào)道指出細(xì)胞內(nèi)Rad51和Ku70蛋白含量的改變能大大提高細(xì)胞的基因打靶效率,但也有資料指出Rad51和Ku70蛋白與細(xì)胞凋亡密切相

6、關(guān)。對于在提高基因打靶效率中,改變這兩種蛋白含量對細(xì)胞凋亡所產(chǎn)生的影響尚不清楚。我們首先通過雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFc)對細(xì)胞的Rad51與p53、Ku70與Bax兩組蛋白之間的相互作用進(jìn)行了研究,研究結(jié)果表明Rad51與p53、Ku70與Bax之間都有相互作用。在雞DF-1細(xì)胞中對Rad51蛋白過量表達(dá)或Ku70基因的表達(dá)進(jìn)行有效干擾后,用流式細(xì)胞技術(shù)和Tunel對DF-1細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測,我們發(fā)現(xiàn):在沒有凋亡脅迫時(shí),這兩種蛋白

7、的含量變化對DF-1細(xì)胞凋亡的影響很小;但Rad51和Ku70的過量表達(dá)能阻抑DF-1細(xì)胞在STS誘導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡,而Ku70的干擾則促進(jìn)細(xì)胞在STS誘導(dǎo)下的DF-1細(xì)胞凋亡,Rad51能在一定程度上減弱Ku70干擾引起的DF-1細(xì)胞凋亡作用。與Rad51相似,過表達(dá)能促進(jìn)p53蛋白進(jìn)行泛素化降解的Mdm2蛋白也能一定程度上抑制STS對DF-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。已有的資料表明P53的蛋白修飾對于Bax的轉(zhuǎn)錄是必需的,但我們的Weste