胰腺癌中異常表達(dá)的microRNA對(duì)其分子發(fā)病機(jī)制的影響.pdf

1、背景： 胰腺癌的發(fā)病率近年有升高趨勢(shì)。因其惡性程度極高，且目前臨床的診治手段效果均欠佳，發(fā)展診治該腫瘤的新方法顯得較為迫切。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，在該領(lǐng)域內(nèi)探討該腫瘤的發(fā)病機(jī)理和探索新的診療手段成為近期熱點(diǎn)。本文探討MicroRNA（miRNA）在胰腺癌中的異常表達(dá)和在該腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。 目的： 1.比較胰腺癌病人的腫瘤組織和正常胰腺組織的miRNA表達(dá)譜。并初步篩選出在胰腺癌組織中表達(dá)明顯異常的

2、miRNA分子。 2.了解部分在胰腺癌中異常表達(dá)的miRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響。 3.選擇對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)或凋亡有明顯影響的miRNA分子，了解其在胰腺癌發(fā)病的信號(hào)途徑中所起的作用。 4.通過本研究，希望為胰腺癌的治療提供新的分子靶點(diǎn)，為胰腺癌相關(guān)的診斷、預(yù)后標(biāo)志物研究提供新的內(nèi)容。 方法： 1.利用miRNA芯片技術(shù)比較胰腺癌組織，胰腺癌細(xì)胞株ASPC-1和正常胰腺組織的miRNA表達(dá)

3、差異。 23.根據(jù)表達(dá)譜結(jié)果，選擇部分差異表達(dá)的miRNA（miR-21，24，191，221），利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染反義核苷酸的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，單獨(dú)和聯(lián)合下調(diào)miRNA的活性。利用熒光顯微鏡和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)該方法的有效性。利用MTT法分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞活力的變化；caspase3檢測(cè)和流式細(xì)胞儀FITC-AnnexinⅤ/PI法分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡的變化。流式細(xì)胞PI法分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)周期的變化。 3.根據(jù)下調(diào)miRNA

4、后對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，選擇其中影響最明顯的miR-21。利用生物信息學(xué)查找其可能與胰腺癌發(fā)病相關(guān)的靶基因，并選擇其中的PTEN基因，利用熒光定量PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)，分別檢測(cè)下調(diào)miR-21后PTEN mRNA和PTEN蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1.利用miRNA芯片技術(shù)，在胰腺癌組織和細(xì)胞株中，共檢測(cè)了416個(gè)人類miRNAs分子。發(fā)現(xiàn)其中有40個(gè)miRNAs分子升高，127個(gè)miRNAs降

5、低。 2.本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染反義核苷酸的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其下調(diào)miRNA的有效性得到證實(shí)。下調(diào)不同的miRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)各指標(biāo)有不同影響。綜合評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)的各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其中有明顯影響的組為：?jiǎn)为?dú)下調(diào)mir-21增加細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞活性；單獨(dú)下調(diào)mir-221改變細(xì)胞周期，減少增殖期細(xì)胞，增加G0G1期細(xì)胞。但對(duì)細(xì)胞活性影響無明顯影響；mir-221和mir-21共同下調(diào)時(shí)，細(xì)胞活力較mir-21單獨(dú)轉(zhuǎn)染進(jìn)一步下降。其它轉(zhuǎn)

6、染各組對(duì)以上各項(xiàng)細(xì)胞生長(zhǎng)指標(biāo)影響則不明顯。 3.下調(diào)mir-21后，PTEN mRNA變化不明顯，但PTEN蛋白表達(dá)明顯升高。 全文結(jié)論： 1.胰腺癌組織和細(xì)胞株中，均存在大量異常表達(dá)的miRNAs分子。 2.僅部分在胰腺癌中異常表達(dá)的miRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡有直接影響，選用一定組合的聯(lián)合轉(zhuǎn)染，miRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響可比在單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)加強(qiáng)。 3.miR-21可在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平阻止