沉默cxcr4基因表達抑制胰腺癌增殖和侵襲的體外研究

1、<p>　　阻斷沉默CXCR4基因表達抑制胰腺癌增殖和侵襲轉移的體外實驗研究</p><p>　　王 錚，李徐奇，徐 軍，仵 正，張 東，沙煥臣，馬清涌 (710061 西安，西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科)</p><p>　　[摘要] 目的 利用RNAi技術構建CXCR4 shRNA表達載體，觀察CXCR4基因干擾后胰腺癌細胞增殖、及侵襲能力的變化。方法

2、 在不同分化程度胰腺癌細胞株中篩選出CXCR4高表達胰腺癌細胞株，RNAi技術構建CXCR4 shRNA表達載體，轉染胰腺癌CXCR4高表達細胞Miapaca-2并應用G418篩選出穩(wěn)定表達株，Real-time PCR、Western blot實驗觀察RNAi對CXCR4基因的抑制效率；MTT實驗、檢測CXCR4基因干擾后胰腺癌細胞增殖，應用Transwell侵襲小室觀察CXCR4干擾對胰腺癌細胞侵襲轉移力的影響。P<0.05被

3、認為具有顯著差異性。結果 胰腺癌細胞株Miapaca-2 CXCR4表達異常增高，特異性CXCR4基因沉默能夠在基因和蛋白水平穩(wěn)定、高效、特異地抑制CXCR4的表達，抑制效率達70%以上，。同時，特異性CXCR4 shRNA能夠抑制細胞生長，細胞達到對數生長期的時間延長(P<0.05)，此外，。Transwell實驗證明CXCR4基因干擾后細胞侵襲能力減低 (P<0.05)，即使SDF-1的刺激也不能夠使細胞侵襲能力增加。結

4、論 </p><p>　　[關鍵詞] CXCR4; 胰腺癌; 侵襲轉移</p><p>　　[中圖法分類號] R735. 9 [文獻標志碼] A</p><p>　　The effects of CXCR4 inhibited by RNA interference on pancreatic cancer proliferation a

5、nd in vitro </p><p>　　Wang Zheng, Li Xuqi, Xu Jun, Wu Zheng, Zhang Dong, Sha Huanchen, Ma Qingyong (Department of Hepatobilary Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical College of Xi’an Jiaotong U

6、niversity, Xi’an, Shaanxi, 710061, China) </p><p>　　[Abstract] Objective Extra-pancreatic metastasis is a difficult problem for surgical intervention on pancreatic cancer. CXCR4 was considered as an importan

7、t role in this process. The aim was to observe the influence of CXCR4 knockdown on pancreatic cancer cell growth, cell cycle, cell tumorigenesis, cell invasive ability. Methods RNAi technique was applied to construct the

8、 CXCR4 shRNA expression vector. Lipofecatime 2000 was used to transfect the CXCR4 high expression pancreatic cancer cell Miap</p><p>　　[Key Words] CXCR4; Pancreatic cancer; Tumor invasion and metastasis</

9、p><p>　　Supported by the National Natural Science Foundation of China (81172195, 30700817). The Fundamental Funding of Xi’an Jiaotong University (2010, No 05). Corresponding author: Qingyong Ma, Tel:029-8532389

10、9, E-mail:qyma56@mail.xjtu.edu.cn</p><p>　　問題1：請補充基金項目及通信作者英文信息，與中文寫法一一對應</p><p>　　[基金項目] 國家自然科學青年基金（81172195,30700817），2010西安交通大學醫(yī)學創(chuàng)新研究基金（問題2：補充項目編號或者年分）基本科研業(yè)務費國內外合作項目（2011，No.05）</p>&

11、lt;p>　　[通信作者] 馬清涌，電話:（029）85323899, E-mail:qyma56@mail.xjtu.edu.cn</p><p>　　胰腺癌惡性度高，早期容易發(fā)生侵襲轉移，死亡率居世界癌癥死亡第4位。胰腺癌根治性手術切除率低，5年生存率不足5%，外科手術往往不能夠得到滿意的效果[1-2]。隨著分子生物學手段的不斷進展，生物治療越來越多的得到了人們的重視，針對血管生成、表皮生長因子等多個

12、途徑的藥物已經進入了不同的臨床階段[32]。在針對腫瘤的侵襲轉移研究中，趨化因子的作用是目前的研究熱點，由于趨化因子能夠誘導具有相關受體的腫瘤細胞游走到特異的器官，，調控趨化因子被認為是調節(jié)腫瘤轉移的一個重要的途徑[43]。胰腺癌常發(fā)生肝轉移、肺轉移，而在肝臟、肺臟等組織中基質源性細胞因子1（問題3：首次出現的英文縮寫請給出其中英文全稱）SDF-1（Stromal derived factor-1, SDF-1,又名CXCL12）呈現高

13、表達。CXCR4是SDF-1已知的唯一的趨化因子受體[54]。（問題4：引用文獻？）課題組前期結果研究發(fā)現CXCR4在胰腺癌組織中異常表達，并且與胰腺癌預后明確相關[5]。因此，以CXCR4作為胰腺癌基因治療靶點具有一定的作用臨床應用前景。由于RNAi提供了一種特異性基因功能失活的方法，可以作為一種簡單有</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p

14、>　　1.1 主要試劑與材料</p><p>　　不同分化程度的胰腺癌細胞（PC-2, PC-3, Miapaca-2, BXPC-3, PANC-1）由西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中心實驗室保存。限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ及膠回收試劑盒（TaKaRa公司），轉染試劑Lipofeetamine 2000(Invitrogen公司)，質粒抽提試劑盒(天跟生化科技有限公司)，寡核苷酸及測序(上海生工

15、合成)，Real-time PCR反應體系(MBI公司)，G418及DMEM（Gibco公司），兔抗人CXCR4（Neomarker公司）及HRP-羊抗兔抗體(中杉公司)。碘化丙啶(PI)及Hoechest染料(碧云天公司)。載體pRNAT-U6.1/Neo由西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中心實驗室李旭教授饋贈。</p><p>　　1.2 Real-time PCR檢測CXCR4 mRNA表達</p&g

16、t;<p>　　按Trizol試劑盒說明使用氯仿和異丙醇抽提總RNA。使用逆轉錄試劑盒，采用Oligo DT和逆轉錄酶合成cDNA鏈。PCR引物采用Primer Premier 5引物設計軟件設計，由上海生工公司合成。Real-time PCR在ABI7300機器上進行反應實驗操作同前，采用兩步法，進行所需擴增的基因引物擴增如下：。（問題5：請標明5’與3’端）CXCR4上游, F: 5′-CTGTGAGCAGAGGGT

17、CCAG-3'; R: ，下游：5′-ATGAATGTCCACCTCGCTT-3'; GAPDH: F上游: 5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'，下游; R: 5′- GCCCAATA CGACCAAATCC-3'。反應條件設置如下：預變性94 ℃，5 min；94 ℃，15 s；60℃，60 s；40個循環(huán)；溶解曲線條件：95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s。Real-time

18、- PCR反應完成后，進行一個循環(huán)的溶解曲線反應用來反映擴增的特異程度。待測基因的表達水平通過2?ΔΔCT（即與管家基因ct值差值的差值）方法進行檢測[7]。</p><p>　　1.3 Western blot檢測CXCR4蛋白表達</p><p>　　胰腺癌細胞生長達70%后，經PBS漂洗，然后將預冷至4 ℃的RIPA裂解緩沖液（用時加入Cocktail proteinase inhi

19、bitor 10 µl以及適量PMSF）加入其中，細胞刮子收集細胞，冰浴30 min，12 000 r／min離心15 min后，上清液保存于-80℃。采用Bradford法測定蛋白質濃度，每孔上樣40 µg，10％SDS-PAGE凝膠電泳分離，通過電轉移法將蛋白質從SDS-PAGE凝膠轉移至硝酸纖維素膜。后者在含5％脫脂奶粉的TBST中37 ℃封閉2 h，加入以封閉液稀釋的一抗（CXCR4，1:200；GAPDH:

20、1:400），封閉雜交袋，4 ℃過夜。TBST充分漂洗(15 min×3次)，分別加入以牛奶封閉的HRP標記二抗（anti-rabbit:1:1500，anti-mouse 1:2000），室溫下孵育2h；TBST充分漂洗(20 minx min，3次)，化學熒光法(ECL)顯色，觀察結果。凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄，蛋白表達以光密度表示，以目的蛋白/GAPDH表示蛋白的相對表達，全自動凝膠成像系統(tǒng)對結果進行分析并拍照。</p

21、><p>　　1.4 設計和構建CXCR4 shRNA表達載體</p><p>　　從GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得人CXCR4 mRNA的基因序列，共有2個序列，其中NM_003467是目前人CXCR4 mRNA研究最多的序列。依據Tuschl等[8]關于siRNA的設計原則，利用互聯網上軟件程序設計針對CXCR4 mRNA（NM_003467）

22、基因CDS區(qū)的siRNA的序列，利用BLAST比較設計的序列和人類基因組數據庫，排除和其他基因明顯同源的靶序列，設計3條序列，其中包括2條CXCR4 mRNA的Oligo序列（1#，2#）和1條作為負對照的無關序列（N#）。（問題6：請寫明大小寫區(qū)別想說明什么？）1#正義鏈：5′-gatccgTGAGAAGCATGACGGACAAttcaagagaTTGTC CGTCATGCTTCTCA tttttggaaa-3'3，反義鏈：5

23、′-agcttttccaaaaaaTGAGAAGCATGACGGACAA tctcttgaaTTGTCCGTCATGCTTCTCA cg-3'；2#正義鏈：5′-gatccAGCGAGGTGGACATTCA TCttcaagagaGATGAATGTCCAC</p><p>　　1.5 質粒轉染及CXCR4 shRNA穩(wěn)定表達細胞的建立</p><p>　　參照Lipofectami

24、ne2000轉染試劑盒說明書進行轉染。轉染前24 h，取對數生長期的胰腺癌細胞進行消化，細胞計數板計數，用含10%FBS，無抗生素的DMEM培養(yǎng)基調整細胞數為4×105/ml，以0.5 ml/孔于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，Miapaca-2細胞培養(yǎng)達到70%左右融合后進行轉染；瞬時轉染48 h后消化細胞，按1：10接種于6孔板，用含10% FBS，無抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加G418 400 µg/ml進行穩(wěn)定轉染

25、篩選，每3～5日換液；2～3周后，6孔培養(yǎng)板出現多個G418抗性的克隆，由于質粒帶有GFP的表達，在鏡下可看到帶綠色熒光的陽性克隆。顯微鏡下，用小槍頭吸取少量胰酶，進行消化挑取帶綠色熒光的單個克?。惶羧〉目寺∫迫?4孔培養(yǎng)板，G418培養(yǎng)基200 μg/ml進行繼續(xù)維持培養(yǎng)，經過8周周可以獲得穩(wěn)定轉染的克隆。必要時通過有限稀釋法再次篩選單克隆陽性細胞，在96孔板進行擴大培養(yǎng)。</p><p>　　1.6 MTT法

26、檢測特異性CXCR4 shRNA對Miapaca-2細胞生長的抑制作用</p><p>　　細胞1×104/孔接種于5塊96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設4個復孔，同時設空白對照組只加培養(yǎng)液，每孔體積200 µl；將培養(yǎng)板移入37 ℃，飽和濕度條件下的孵箱中培養(yǎng)；分別在24、48、72、96 h和120 h后，每孔加入MTT溶液5 mg/ml 20 µl，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄上清后加

27、入150 µl DMSO，振蕩10 min，用酶聯免疫檢測分析儀測定D(490)值；以只加培養(yǎng)液，不加細胞的空白對照孔調零，以空白對照孔調零，于自動酶標讀數儀上測定各孔吸光度值，計算各組細胞的平均值；記錄結果，以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。</p><p>　　1.7 Transwell小室檢測CXCR4干擾后胰腺癌細胞Miapaca-2細胞侵襲能力</p>&l

28、t;p>　　Boyden小室分為上、下兩室，中間為孔徑為8 μm的聚碳酯膜，膜的上室可以鋪基質凝膠（Matrigel）。將各實驗組的細胞消化，以無血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞數至2.5×105/ml備用；以200 µl無血清的DMEM培養(yǎng)液水化Transwell小室，盡量吸盡小室內殘留的培養(yǎng)液；吸取400 µl細胞懸液加入到Transwell小室的上室；Transwell小室的下室加入10% FBS的

29、DMEM培養(yǎng)基或含100 ng/ml SDF-1α和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基作趨化液；將細胞置于37 ℃，CO2孵箱培養(yǎng)20 h；取出小室，以棉簽小心擦除濾膜上室面的細胞，以4%多聚甲醛固定黏附在下室面的細胞；Giemsa（1：9稀釋，現用現配）染色；顯微鏡下觀察處于微孔濾膜外側面上的細胞，鏡下計數濾膜下表面的遷移到了的細胞數，隨機計數5個視野的細胞數目，每個標本重復3 次，實驗重復2 次。以穿出細胞的相對數目來表示腫瘤細胞的侵襲

30、能力。每個標本重復3次，實驗重復2次。</p><p><b>　　1.8 統(tǒng)計學分析</b></p><p>　　采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析并應用LSD法行兩兩比較（問題7：兩兩比較用什么檢驗？）。</p><p><b>　　2 結果</b></p&

31、gt;<p>　　2.1 CXCR4在胰腺癌細胞株中的表達</p><p>　　應用五5種具有不同侵襲轉移能力的胰腺癌細胞進行CXCR4 mRNA以及蛋白表達的檢測。應用Western blot以及Real-time PCR結果顯示，CXCR4 mRNA在胰腺癌細胞中具有不同程度的表達，其中Miapaca-2和PANC-1細胞CXCR4 mRNA水平表達較高（圖1），。在蛋白水平的檢測方面， Mia

32、paca-2細胞CXCR4蛋白具有明顯高表達（圖22）。因此，在后續(xù)試驗中，應用CXCR4高表達的Miapaca-2細胞作為靶細胞進行研究。（問題8：請附電泳圖片）</p><p>　　2.2. 特異性CXCR4 shRNA表達載體的鑒定</p><p>　　經過BamHI 和 HindIII的酶切后的質粒只剩下線形結構，酶切后質粒大小以及插入片段大小得到了確認。對酶切正確的質粒進行測序（

33、圖3），測序結果如插入片段完全一致的，表明重組成功，分別命名為pRNAT-M1（轉染1#質粒），pRNAT-M2（轉染2#質粒），pRNAT-MN（轉染N#質粒）。</p><p>　　2.3 特異性CXCR4 shRNA表達載體轉染Miapaca-2細胞</p><p>　　構建的質粒帶有GFP基因，因此可以在熒光顯微鏡下觀察綠色的表達。G418篩選濃度為400 μg/ml。從轉染后24

34、h開始應用熒光纖維顯微鏡（問題9：？？？）觀察，24h Miapaca-2的轉染效率為20%～30%，；轉染細胞經過G418篩選，單克隆擴大培養(yǎng)后，表達GFP的細胞逐漸增加，不表達的細胞逐漸減少。經過2次有限稀釋法對細胞進行單克隆的篩選并擴大培養(yǎng)后，鏡下可見穩(wěn)定轉染的細胞90%以上表達綠色熒光蛋白（圖43）。</p><p>　　2.4 特異性CXCR4 shRNA對Miapaca-2細胞CXCR4 mRNA表達

35、的抑制作用</p><p>　　轉染空質粒組的pRNAT-MN CXCR4 mRNA水平下降不明顯(P>0.05)，而利用Realtime PCR方法檢測shRNA對Miapaca-2細胞CXCR4 mRNA的抑制作用。應用 2?ΔΔCT 方法利用對GAPDH和CXCR4 mRNA的ct差值進行分析，如圖5所示，pRNAT-M1、pRNAT-M21的CXCR4 mRNA水平都明顯下降，pRNAT-M1最為明

36、顯其中pRNAT-M1、pRNAT-M2的CXCR4 mRNA 相對表達量為0.21±0.03,、0.38±0.04。與pRNAT-MN相比，pRNAT-M1的CXCR4 mRNA抑制效率約70%(P<0.01)，且抑制效果較pRNAT-M2強，抑制率達到70%左右(P<0.05)，因此。見圖5。用pRNAT-M1進行后續(xù)的實驗。</p><p>　　2.5 特異性CXCR4 sh

37、RNA對Miapaca-2細胞CXCR4蛋白表達的抑制作用</p><p>　　通過提取細胞總蛋白進行提取細胞總蛋白進行Western blot分析，如圖4可見，我們應用GAPDH作為內參控制樣品的內部質量，通過將目的蛋白與GAPDH對比，數據顯示pRNAT-M1、pRNAT-M2的CXCR4 蛋白相對表達量為0.29±0.02,、0.57±0.03，GAPDH在各組之間無明顯變化，pRNAT

38、-MN與Miapaca-2的CXCR4蛋白水平無明顯差異(P>0.05)；而與pRNAT-MN相比，可見pRNAT-M1細胞CXCR4表達受到了顯著的抑制（P<0.05）（P<0.05，圖6），并且1號質粒能夠得到最佳的沉默效率，與Realtime-PCR結果一致。</p><p>　　2.6 特異性CXCR4 shRNA對Miapaca-2細胞細胞增殖的影響 </p><p

39、>　　用MTT比色法比較RNAi干擾前后細胞增殖能力的變化。pRNAT-M1組細胞的增殖速度比正常細胞和負對照組細胞顯著減慢，通過對OD值的分析，我們發(fā)現從第4天開始pRNAT-M1與pRNAT-MN之間具有顯著性差異(P<0.05)，并隨之時間的延長差異增加，而pRNAT-MN與正常細胞之間沒有明顯的差異（圖75）。這一結果提示，這種結果說明CXCR4基因被干擾后，Miapaca-2細胞增殖能力降低。</p>

40、<p>　　2.7特異性CXCR4 shRNA對Miapaca-2細胞侵襲力的影響</p><p>　　采用Transwell小室來檢測CXCR4基因干擾前后細胞侵襲力的情況，在正常10%FBS的DMEM培養(yǎng)基趨化下，pRNAT-M1細胞穿過小室的細胞數為38.02±8.32, pRNAT-MN細胞穿過小室的細胞數為47.35±4.64，pRNAT-M1細胞通過小室人工基底膜的細胞

41、數與pRNAT-MN相比明顯減少(P<0.05)。利用CXCR4目前發(fā)現的唯一的配體SDF-1進行趨化，可以看到pRNAT-M1、pRNAT-MN的細胞穿膜數分別為41.27±7.21、86.28±6.17，pRNAT-MN細胞穿透能力明顯增強（P<0.05），而pRNAT-M1細胞并沒有明顯改變 (P>0.05)。，見圖86。</p><p><b>　　3 討論

42、</b></p><p>　　RNAi即RNA干擾技術，是一種可靠的阻止或抑制基因表達的方法，指一些小的雙鏈RNA可以特異、高效地阻斷體內特定基因的表達，促使其降解，誘導細胞表達出特定基因缺失的表型，由于這是一種在RNA水平的基因表達抑制，故稱為RNA干擾。雙鏈RNA可以干擾細胞內同源基因的表達，這種現象由Fire等在1998年對線蟲的研究中發(fā)現的[9，10]。本實驗中，我們利用Genbank檢索相關

43、序列，根據Tuschl等的“The siRNA user guide”原則，針對CXCR4（NM_003467）選擇并設計2條靶序列和1條無相關序列。一個完整的實驗均設有無相關序列作為負對照以驗證其特異性。作為負對照和選中的序列有相同的核苷酸組成，但是和任何基因沒有同源性。在發(fā)夾siRNA轉錄模板寡核苷酸的設計及合成時，根據siRNA靶序列設計兩個反向互補排列的DNA模板單鏈，其間應用LOOP相連接，形成莖環(huán)的發(fā)夾結構。關于LOOP的脫

44、氧核昔酸的數量與siRNA干擾效果的問題文獻報道不一，但多傾向于9個脫氧核苷酸LOOP的siRNA干擾效果較好。所以，在本實驗中采用了TTCAAGAGA的脫氧核苷酸莖環(huán)結構的來形成shR</p><p>　　近年研究發(fā)現，多數腫瘤細胞都表達有廣泛的趨化因子及趨化因子受體，并受趨化因子及其受體生物體系的調控在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中趨化因子受體及其配體表現出重要的作用[118]。因此，以趨化因子及其受體分子為控制靶點

45、，通過激活或拮抗趨化因子受體的信號傳導來控制趨化因子系統(tǒng)的功能，可望用于控制和治療相關疾病，具有潛在的臨床應用前景[129]。最初CXCR4引起人們的關注是由于其在HIV感染中重要作用，；隨著研究的深入，發(fā)現CXCR4是組織表達最為廣泛的細胞因子受體之一，在多種惡性腫瘤細胞的生長、轉移都有很重要的作用。CXCR4與SDF-1相互作用可以促進局部新生血管作用，利于腫瘤生長，腫瘤組織CXCR4表達明顯高于正常組織，而其遠處轉移部位均為SDF

46、-1表達豐富的器官，從而定向誘導腫瘤細胞轉移到特定的靶器官；。SDF-1與CXCR4結合后可使細胞肌動蛋白絲聚合，可形成假偽足，定向遷移、侵襲，形成“趨向性學說”[13]。許多惡性腫瘤如前列腺癌、腎癌、喉癌、神經母細胞瘤、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌及造血系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤中異常表達CXCR4[1410-14]。Muller等發(fā)現CXCR4在一些惡性乳腺癌</p><p>　　前期研究發(fā)現CXCR4在胰腺癌組織中異常表

47、達，并且與預后明顯相關[19]。在體外實驗中，我們應用五5種不同分化程度的胰腺癌細胞進行CXCR4表達的檢測，在研究中我們發(fā)現未分化的Miapaca-2 CXCR4 mRNA表達及蛋白表達明顯升高，由于五種胰腺癌細胞分化程度不一，Miapaca-2細胞為未分化胰腺癌細胞，考慮惡性度較高胰腺癌細胞表達CXCR4更高。在實驗中，此外，我們成功構建重組質粒pRNAT-U6.1/ Neo-CXCR4 shRNA，經陽離子脂質體lipofecta

48、mine2000轉染Miapaca-2細胞，瞬時轉染率較低約（20%-30%，）。為了克服瞬時轉染存在的轉染效率低、表達不長久且不穩(wěn)定等特點，我們在瞬時轉染后48h開始進行G418篩選，在這種篩選壓力下，由于抗性基因的作用，表達重組質粒的細胞將會被保留，未轉染該質粒的細胞將會被殺死，最終篩選出穩(wěn)定表達重組質粒的Miapaca-2細胞。經過反復的有限稀釋單克隆化，在熒光顯微鏡和G418篩選的壓力下，獲得了能夠了穩(wěn)定轉染的細胞。</p

49、><p>　　利用Realtime-PCR方法和Western blot檢測特異性CXCR4 shRNA對CXCR4 mRNA和蛋白的抑制效果。結果表明，CXCR4 shRNA均表現出顯著的抑制能力，以1號質粒最為突出，抑制效率約70%，與負對照組和正常細胞CXCR4的表達具有明顯的差異性；根據抑制強度我們采用1號質粒作為主要的研究對象，來進一步研究特異性CXCR4 shRNA對Miapaca-2細胞的影響。國內外研

50、究表明，以SDF-1/CXCR4為代表的趨化因子家族在介導細胞增殖、分化、侵襲轉移等信號傳遞中起著非常重要的作用。CXCR4作為腫瘤研究的一個熱點，越來越多被人們所關注[20]。為了給以CXCR4為靶點的基因治療在胰腺癌中的作用提供理論支持，我們設計了本實驗。實驗中，我們通過MTT比色法測定特異性CXCR4 shRNA對Miapaca-2細胞增殖能力的影響，并繪制出實驗各組細胞的生長曲線。結果顯示，CXCR4 shRNA組與負對照組和正

51、常細胞相比，增殖能力顯著下降，曲線平緩，進入對數生長期較慢，而無義序列組與正常細胞組相比無明顯的差異性，增殖是腫瘤生長的一個特性，CXCR4的基因沉默能夠</p><p>　　綜上所述，在CXCR4沉默的胰腺癌細胞株中，胰腺癌的侵襲轉移能力得到了有效的抑制。這為CXCR4作為胰腺癌基因治療的靶點提供了理論基礎，實驗結果表明，CXCR4有望成為胰腺癌治療中一個新的新治療靶位，靶向胰腺癌CXCR4基因治療顯示出了潛在

52、的療效和良好的發(fā)展應用前景。</p><p>　?。▎栴}12：討論請重新梳理。請結合本研究結果，引用文獻，展開比較分析。避免文獻綜述。）</p><p>　　參考文獻：(問題13：文獻陳舊，請補充近3年文獻。請引用本刊近2年相關文獻，并在文中順序標引)</p><p>　　趙玉沛. 胰腺癌診斷與治療的現狀與未來[J]. 中華肝膽外科雜志，2009, 15(5):32

53、1-324</p><p>　　Vincent A，Herman J, Schulick R,et al. Pancreatic cancer[J]. Lancet, 2011,378(9791):607-620. </p><p>　　Mantovani A, Savino B, Locati M, et al. The chemokine system in cancer bio

54、logy and </p><p>　　therapy [J]. Cytokine Growth Factor Rev. 2010, 21(1):27-39.</p><p>　　Billadeau DD, Chatterjee S, Bramati P, et al.Characterization of the CXCR4 signaling in pancreatic canc

55、er cells [J]. Int J Gastrointest Cancer, 2006, 37(4):110-119</p><p>　　王錚，馬清涌，李軍輝等 CXCR4和β-catenin在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 中國普外基礎與臨床雜志, 2011，17(10):1071-1076</p><p>　　Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein

56、 E, et al. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells[J]. Genes Dev, 2002, 16 (8): 948-958</p><p>　　Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data u

57、sing real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods, 2001, 25 (4): 402-408</p><p>　　Duda DG, Kozin SV, Kirkpatrick ND et al. CXCL12 (SDF1alpha)-CXCR4/CXCR7 pathway inhibition: an

58、emerging sensitizer for anticancer therapies? [J]. Clin Cancer Res. 2011, 17(8):2074-2080</p><p>　　Patrussi L, Baldari CT. The CXCL12/CXCR4 axis as a therapeutic target in cancer and HIV-1 infection [J]. Cur

59、r Med Chem. 2011;18(4):497-512.</p><p>　　黃紹崧,楊輝,卞修武等. 趨化因子受體CXCR4的表達與垂體腺瘤侵襲性關系的初步研究[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2005;27(20):2063-2066.</p><p>　　Muller A, Homey B, Soto H, et al. Involvement of chemokine recept

60、ors in breast cancer metastasis[J]. Nature, 2001; 410 (6824): 50-56</p><p>　　Torregrossa L, Giannini R, Borrelli N, et al. CXCR4 expression correlates with the degree of tumor infiltration and BRAF status in

61、 papillary thyroid carcinomas [J]. Mod Pathol. 2011 Sep 9. doi: 10.1038/modpathol.2011.140. [Epub ahead of print]</p><p>　　張園園,胡國華,袁琨等. SDF-1/CXCR4對喉癌細胞歸巢的作用[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2010;32(12):1316-1320.</p>&l

62、t;p>　　Sacanna E, Ibrahim T, Gaudio M, et al. The role of CXCR4 in the prediction of bone metastases from breast cancer: a pilot study[J]. Oncology, 2011;80(3-4):225-31.</p><p>　　Koshiba T, Hosotani R, Miy

63、amoto Y, et al. Expression of stromal cell-derived factor 1 and CXCR4 ligand receptor system in pancreatic cancer: a possible role for tumor progression [J]. Clin Cancer Res, 2000, 6 (9): 3530-3535.</p><p>　

64、　Saur D, Seidler B, Schneider G, et al. CXCR4 expression increases liver and lung metastasis in a mouse model of pancreatic cancer [J]. Gastroenterology, 2005, 129 (4): 1237-1250</p><p>　　Maréchal R, De

65、metter P, Nagy N, et al. High expression of CXCR4 may predict poor survival in resected pancreatic adenocarcinoma[J]. Br J Cancer. 2009, 100(9):1444-1451</p><p>　　Duda DG, Kozin SV, Kirkpatrick ND, et al. CX

66、CL12 (SDF1alpha)-CXCR4/CXCR7 pathway inhibition: an emerging sensitizer for anticancer therapies?[J]. Clin Cancer Res. 2011, 17(8):2074-80.</p><p>　　趙玉沛. 胰腺癌診斷與治療的現狀與未來[J]. 中華肝膽外科雜志，2009, 15(5):321-324.</

67、p><p>　　陸星華．胰腺癌研究現狀與展望[J]．美中醫(yī)學，2005, 2(3):73.</p><p>　　Bockman DE, Guo J, Buchler P, et al. Origin and development of the precursor lesions in experimental pancreatic cancer in rats[J]. Lab Invest,

68、 2003, 83 (6): 853-859.</p><p>　　Slettenaar VI, Wilson JL. The chemokine network: a target in cancer biology? [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2006, 58 (8): 962-974.</p><p>　　Billadeau DD, Chatterjee S,

69、 Bramati P, et al.Characterization of the CXCR4 signaling in pancreatic cancer cells [J]. Int J Gastrointest Cancer, 2006, 37(4):110-119.</p><p>　　Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, et al. Short hairpin RNA

70、s (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells[J]. Genes Dev, 2002, 16 (8): 948-958.</p><p>　　Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative

71、 PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods, 2001, 25 (4): 402-408.</p><p>　　J. Harborth, S. M. Elbashir, K. Bechert, et al. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small

72、 interfering RNAs [J]. J. Cell Science, 2001, 114（pt24）: 4557-4565.</p><p>　　Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].

73、Nature, 1998, 391 (6669): 806-811.</p><p>　　Tijsterman M, Ketting RF, Plasterk RH. The genetics of RNA silencing[J]. Annu Rev Genet, 2002, 36: 489-519</p><p>　　Zou YR, Kottmann AH, Kuroda M, et

74、al. Function of the chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development[J]. Nature, 1998, 393 (6685): 595-599.</p><p>　　Kim CH, Broxmeyer HE. Chemokines: signal lamps for trafficking of

75、T and B cells for development and effector function[J]. J Leukoc Biol, 1999, 65 (1): 6-15.</p><p>　　Soon LL. A discourse on cancer cell chemotaxis: where to from here? [J]. IUBMB Life, 2007, 59 (2): 60-67.&l

76、t;/p><p>　　Arya M, Ahmed H, Silhi N, et al. Clinical importance and therapeutic implications of the pivotal CXCL12-CXCR4 (chemokine ligand-receptor) interaction in cancer cell migration [J]. Tumour Biol, 2007;

77、28 (3): 123-131.</p><p>　　Muller A, Homey B, Soto H, et al. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J]. Nature, 2001; 410 (6824): 50-56.</p><p>　　Koshiba T, Hosotani R, Mi

78、yamoto Y, et al. Expression of stromal cell-derived factor 1 and CXCR4 ligand receptor system in pancreatic cancer: a possible role for tumor progression [J]. Clin Cancer Res, 2000, 6 (9): 3530-3535.</p><p>

79、　　Saur D, Seidler B, Schneider G, et al. CXCR4 expression increases liver and lung metastasis in a mouse model of pancreatic cancer [J]. Gastroenterology, 2005, 129 (4): 1237-1250.</p><p>　　Billadeau DD, Cha

80、tterjee S, Bramati P, et al. Characterization of the CXCR4 signaling in pancreatic cancer cells [J]. Int J Gastrointest Cancer, 2006, 37 (4): 110-119.</p><p>　　T, Wolfert F, Schimanski CC, et al. Strong expr

81、ession of chemokine receptor CXCR4 by pancreatic cancer correlates with advanced disease [J]. Oncol Rep, 2006, 16 (6): 1159-1164.</p><p>　　Darash-Yahana M, Pikarsky E, Abramovitch R, et al. Role of high expr

82、ession levels of CXCR4 in tumor growth, vascularization, and metastasis [J]. Faseb J, 2004, 18 (11): 1240-1242.</p><p>　?。ň庉?龍 亮）</p><p>　?。ㄊ崭澹?011-10-10；修改：；）</p><p>　　圖1 Realti

83、me-PCR分析CXCR4 mRNA在五種胰腺癌細胞中的表達；</p><p>　　（PC-2：2.49±0.11，</p><p>　　PANC-1：2.73±0.26</p><p>　　PC-3：1.0±0.05</p><p>　　BXPC-3：0.87±0.11</p><

84、p>　　Miapaca-2： 2.91±0.22</p><p>　　1:PC-2; 2:PC-3;3:Miapaca-2;4:BXPC-3;5:PANC-1</p><p>　　圖2. Western Blot分析CXCR4蛋白在五種胰腺癌細胞中的表達</p><p>　　圖3 1#，2#，N#質粒G418篩選后細胞普通顯微鏡（上）和熒光顯微鏡

85、下（下）觀察（×40）</p><p><b>　　標尺：100μm</b></p><p>　　1: pRNAT-M1; 2: pRNAT-M2; 3: pRNAT-MN; 4 : Miapca-2</p><p>　　圖4 特異性CXCR4 shRNA對Miapaca-2細胞CXCR4蛋白表達的作用</p>

86、<p>　　圖5 實驗各組細胞體外MTT法增殖能力比較</p><p>　　Miapaca-2: 24h, 0.982±0.105; 48h, 1.250±0.115; 72h, 1.838±0.103; 96h, 2.43±0.319; 120h, 3.17±0.198</p><p>　　pRNAT-MN: 24h,

87、0.933±0.088; 48h, 1.296±0.124; 72h, 1.855±0.149; 96h, 2.397±0.204; 120h, 3.073±0.278</p><p>　　pRNAT-M1: 24h, 0.890±0.139; 48h, 1.285±0.237; 72h, 1.621±0.314; 96h, 1.

88、850±0.467; 120h, 2.350±0.334</p><p>　　a, pRNAT-MN在10%FBS的培養(yǎng)基；b, pRNAT-MN在含100ng/ml SDF-1的10%FBS的培養(yǎng)基；</p><p>　　c, pRNAT-M1在10%FBS的培養(yǎng)基；d, pRNAT-M1在含100ng/ml SDF-1的10%FBS的培養(yǎng)基。</p>

89、<p>　　圖6 Transwell分析不同實驗組細胞之間侵襲能力的比較 (Giemsa染色，×200). 標尺：100μm</p><p>　?。▎栴}14：語言精練不夠，不少語句重復，請通讀全文精練文字）</p><p>　　（問題15：圖片較多，請作精減，保留重點）</p><p>　　圖1 CXCR4 mRNA在胰腺癌細胞中的表達<

90、/p><p><b>　　AB</b></p><p>　　圖2 CXCR4蛋白在胰腺癌細胞中的表達（問題16：請參照近年本刊格式，分別寫明AB是什么？A中各條帶是什么？分子量是多少？寫明B圖橫縱坐標中文標目及單位，提供B圖的含±s數據的EXCEL文檔，便于我們后期制圖）</p><p><b>　　pRNAT-M1：</

91、b></p><p><b>　　pRNAT-M2</b></p><p><b>　　pRNAT-MN</b></p><p>　　圖3 構建的CXCR4表達載體測序圖（問題17：可否進行刪減？）</p><p>　　圖4 1#，2#，N#質粒G418篩選后細胞普通顯微鏡（上）和熒光顯微

92、鏡下（下）觀察（問題18：放大倍數？）</p><p>　　圖5 CXCR4 shRNA表達載體對胰腺癌細胞CXCR4 mRNA表達影響</p><p>　　*，P<0.05,與pRNAT-MN細胞相比（問題19：圖片較多，建議將4個±s數據及其統(tǒng)計分析寫入正文中恰當位置，刪去圖5。）AB</p><p>　　圖6 特異性CXCR4 shRNA對

93、Miapaca-2細胞CXCR4蛋白表達的作用</p><p>　　*，P<0.05,與pRNAT-MN細胞相比（問題20：修改同問題16，或者建議A圖修改，然后將B圖中4個±s數據及統(tǒng)計學處理寫入正文中恰當位置，刪去圖6B。）</p><p>　　圖7 MTT法分析不同組細胞之間細胞增殖情況的變化（問題21：參照近年本刊格式補充圖7橫縱坐標標目、單位，圖中加標志，圖下注

94、明統(tǒng)計學處理）</p><p>　　(問題22：參照本刊圖題重寫，染色方法×放大倍數？)</p><p>　　圖8 CXCR4干擾細胞與對照組之間侵襲能力的比較，*, P<0.05,與pRNAT-MN細胞相比。a, pRNAT-MN在10%FBS的培養(yǎng)基；b, pRNAT-MN在含100ng/ml SDF-1的10%FBS的培養(yǎng)基；c, pRNAT-M1在10%FBS的培養(yǎng)