阿托伐他汀提高豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性心肌梗死療效及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)是急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)干細(xì)胞移植治療的理想供體之一,但心梗后局部惡劣的微環(huán)境不利于移植細(xì)胞的存活,導(dǎo)致其療效受限。前期研究已證實(shí)他汀類藥物可通過改良心肌微環(huán)境,提高干細(xì)胞移植療效,但具體機(jī)制不清。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated prot

2、ein kinase,AMPK)途徑是調(diào)控細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵信號(hào)通路,在缺血心肌中發(fā)揮重要作用；而內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)也參與心肌缺血后微環(huán)境的調(diào)控。因此本課題通過模擬體內(nèi)缺血缺氧環(huán)境,建立缺氧無血清(Hypoxia/Serum—free,H/SF)培養(yǎng)模型,旨在觀察阿托伐他汀(Atorvastatin,Ator)對(duì)體外培養(yǎng)的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響,并研究其是

3、否通過AMPK/eNOS通路發(fā)揮作用。
　　 方法:分離并培養(yǎng)豬BM-MSCs,將第三代細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Nor)、缺氧/無血清對(duì)照組(H/SF)、不同濃度梯度阿托伐他汀組(Ator0.001μM.10μM)、AMPK通路抑制劑Compound C組(10μM,CC)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組BM-MSCs凋亡比例；蛋白免疫印跡法(western bolt,WB)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2水平及AMPK、eNOS及其磷酸

4、化蛋白的水平,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time-PCR)檢測(cè)AMPK和eNOS的基因表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:阿托伐他汀(0.001μM-10μM)可以抑制缺氧/無血清條件誘導(dǎo)的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡(P＜0.05),這種效應(yīng)可以被AMPK通路阻斷劑Compound C抑制(P＜0.001)。蛋白免疫印跡法檢測(cè)顯示阿托伐他汀干預(yù)組凋亡蛋白bax表達(dá)降低,同時(shí)抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)增加。阿托伐他汀治療組AMPK和內(nèi)皮型一氧

5、化氮合酶基因表達(dá)增加,AMPK和內(nèi)皮型一氧化氮合酶的磷酸化水平提高,且二者間存在正相關(guān)性(R=0.599,P=0.004),這種作用同樣可被Compound C抑制。
　　 結(jié)論:阿托伐他汀可以抑制缺血/無血清誘導(dǎo)的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡,這種保護(hù)機(jī)制主要與AMPK通路介導(dǎo)的eNOS活化有關(guān)。
　　 目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow—derived mesenchymal stem cells,BM-MSC

6、s)是急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)干細(xì)胞移植治療的理想供體之一,但心梗后局部惡劣的微環(huán)境不利于移植細(xì)胞的存活,致其療效受限。我們的前期研究已證實(shí)他汀類藥物可通過改良心肌微環(huán)境,提高干細(xì)胞移植療效,但具體機(jī)制不清。因此,本實(shí)驗(yàn)通過建立豬心梗模型,移植自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察阿托伐他汀對(duì)干細(xì)胞移植療效的影響,并分析相關(guān)機(jī)制和信號(hào)通路。
　　 方法:42頭中華小型豬(25±5kg)隨

7、機(jī)分為6組:假手術(shù)組(sham組,n=7),對(duì)照組(AMI組,n=7),阿托伐他汀組(Ator組,n=7),干細(xì)胞移植組(MSCs組,n=7),聯(lián)合治療組(Com組,n=7)和左旋硝基精氨酸組(L-NNA組,n=7)。MSCs、Com及L-NNA組在手術(shù)前3大開始給予阿托伐他汀10mg/天,至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。L-NNA組從手術(shù)當(dāng)大起給予L-NNA150mg/天,至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。通過開胸結(jié)扎前降支第一與第二對(duì)角支之間的冠脈,模擬AMI；90分鐘后松

8、開結(jié)扎線；再灌注30分鐘后,MSCs、Com和L-NNA組通過心肌內(nèi)注射,植自體BM-MSCs500μL(2×107細(xì)胞)。術(shù)后一周檢測(cè)基線心功能及血清學(xué)標(biāo)志物。術(shù)后4周為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),檢測(cè)心功能、血清學(xué)標(biāo)志物,及分析相關(guān)信號(hào)通路蛋白。
　　 結(jié)果:通過正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)(positron emission topography,PET)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),和對(duì)照組相比,Com組心梗面積比例減小6％(95％置信區(qū)間為2.35.9.65％,

9、P=0.002)。通過磁共振影像技術(shù)(magnetic resonance imaging,MRI)檢測(cè)顯示,Com組左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular Oecfion fraction,LVEF)比對(duì)照組上升13.54％(95％置信區(qū)間為9.30—17.78％,P＜0.001),并且左室每搏排血量(ventricular strokevolume,LVSV)增加8.88mL/次(95％置信區(qū)間為5.88—11.87mL/次

10、,P＜0.001)。和對(duì)照組比,MSCs組心梗面積比例減小5.33％(95％置信區(qū)間為1.87—8.80％,P=0.004),LVEF增加5.49％(95％置信區(qū)間為1.25-9.73％,P=0.013)。但是與AMI組相比,單純他汀類藥物治療組的梗死面積和LVEF都沒有顯著改變(P＞0.05)。組織化學(xué)分析萬法顯示,Ator可以增加梗死周邊心肌組織的NO和NOS活性。WB分析顯示,阿托伐他汀可增加AMPK和eNOS的磷酸化水平,并且這

11、一趨勢(shì)和心功能的變化呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.54,P=0.002)。阿托伐他汀還可增加Atk的磷酸化,其蛋白磷酸化趨勢(shì)與eNOS磷酸化的趨勢(shì)呈正相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.479,P=0.018)。同時(shí),阿托伐他汀可以增加JNK磷酸化水平,和c—Jun的水平,并且兩者的蛋白水平趨勢(shì)呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.439,P=0.032)。雖然阿托伐他汀可以增加p53的水平,但是p53蛋白的濃度變化與AMPK磷