AJAP1在腦膠質瘤中異常表達及抑制細胞增殖與侵襲的分子機制研究.pdf

1、腦膠質瘤是最常見的顱內原發(fā)性腫瘤,其中2/3以上為惡性膠質瘤,占成人全身腫瘤約2％,膠質母細胞瘤中位生存期僅1年,5年的生存期幾乎為零。手術切除,術后化療和放療綜合療效仍不是很理想,目前尚無根治方法。腦膠質瘤侵襲性生長的特性是膠質瘤難以根治和復發(fā)的根本原因。因此膠質瘤治療策略的優(yōu)化不僅應著眼在原發(fā)部位腫瘤的治療,還應著力控制腫瘤細胞向正常腦組織的侵襲和轉移。尋找具有抑制膠質瘤細胞侵襲、轉移特性的相關基因,深入揭示其作用機制,對膠質瘤治療

2、具有重要意義。
　　越來越多的證據(jù)表明在人類染色體1p36區(qū)域編碼著許多類似腫瘤抑制基因。最近研究報告發(fā)現(xiàn)粘附連接相關蛋白-1(Adherens Junctional Associated Protein-1,AJAP1,也稱為 Shrew-1)作為另一個類似抑癌基因定位于人類染色體1p36區(qū)域。Radlwimmer研究組對膠質母細胞瘤患者進行基因組雜交和微陣列分析比較, AJAP1首先被描述為一種與膠質母細胞發(fā)生的生物標記物。隨

3、后,Zhang課題組證實在SVHVC, LOVO, SW480,MCF-7等多種細胞系中,AJAP1啟動子區(qū)存在著高度甲基化。但是,在膠質瘤細胞中改變 AJAP1的表達水平影響細胞侵襲和增殖的機制仍然不清楚。
　　本課題重點研究AJAP1在膠質瘤中的異常表達情況,探討其與膠質瘤級別之間的關系,應用AJAP1重組腺病毒轉染技術改變膠質瘤細胞中AJAP1的表達水平,初步探討研究AJAP1對膠質瘤生物學表型的影響及其潛在機制。
　

4、　方法：
　　第一部分應用免疫組織化學染色以及免疫熒光共聚焦成像方法檢測48例膠質瘤標本、5例正常腦組織標本中AJAP1的表達水平,采用Western blot方法對8個膠質瘤細胞系、1個正常細胞系HEK293中AJAP1蛋白表達水平進行檢測,初步研究分析AJAP1與膠質瘤級別之間的關系。
　　第二部分側重于研究人腦膠質瘤細胞轉染AJAP1重組腺病毒后對膠質瘤細胞惡性生物學表型及對細胞骨架影響的體外研究,并初步探討其潛在機制

5、。U87、U251細胞轉染AJAP1重組腺病毒質粒后,Transewell實驗檢測膠質瘤細胞侵襲能力的改變;平板克隆形成試驗檢測細胞的增殖能力;劃痕實驗評價細胞遷移能力。Western blot方法檢測膠質瘤細胞增殖、侵襲等相關指標的變化,同時應用免疫熒光方法檢測過表達AJAP1后對細胞骨架的變化。
　　第三部分則利用顱腦立體定向技術將同時轉染AJAP1重組腺病毒和熒光素酶慢病毒的U87膠質瘤細胞接種在5周大小的BALB/c-nu

6、(SPF)雌性裸鼠尾狀核建立顱內膠質瘤模型,設空白對照組,利用活體生物發(fā)光成像系統(tǒng)( IVIS Lumina Imaging System)動態(tài)觀察腫瘤生長情況及裸鼠的生存期的改變,應用組織病理學方法檢測兩組動物腫瘤標本中增殖、侵襲等蛋白表達水平的變化。
　　結果：
　　通過免疫組化對石蠟切片檢測顯示:膠質瘤樣本中AJAP1的表達水平顯著低于正常腦組織,并且隨著膠質瘤級別的增高,AJAP1的表達隨著降低。組織免疫熒光試驗也同

7、樣證實在高級別的膠質瘤標本中,AJAP1的表達明顯低于低級別膠質瘤標本,與免疫組化結果相符,AJAP1定位于胞漿。因此AJAP1的表達水平與膠質瘤病理分級呈負相關。在膠質瘤細胞系中,Western blot檢測顯示在人胚腎上皮細胞 HEK293中呈高表達,而在大部分膠質瘤細胞系中顯著低表達,以A172、TJ905、TJ899低表達最為顯著。隨后,利用AJAP1重組腺病毒轉染U87、U251膠質瘤細胞,通過提高細胞中AJAP1的蛋白表達水

8、平,AJAP1組與空白對照組及轉染空載體 vector組相比較,平板克隆形成試驗顯示 AJAP1組腫瘤細胞的克隆數(shù)形成減低,transwell試驗顯示AJAP1組細胞的侵襲能力受到明顯抑制,劃痕試驗顯示細胞的遷移能力下降,Western Blot檢測Ki-67、MMP-9蛋白的表達水平均有明顯的下調。在細胞免疫熒光試驗中,過表達AJAP1后, U87、U251細胞骨架結構發(fā)生改變,AJAP1組與vector組相比較,細胞生長模式發(fā)生改變

9、,由原來的球狀聚集生長形態(tài)變?yōu)槠瑺钌L,絲狀偽足明顯減少。
　　在體內動物實驗中,活體動物生物熒光成像結果證實U87-AJAP1組成瘤明顯小于U87-vector組,且vector組于32d內全部死亡,AJAP1組32d內僅死亡4只。免疫組化結果表明AJAP1的表達明顯上調,而Ki-67、MMP-9的表達明顯下調,與細胞實驗結果相符。
　　結論：
　　1.以正常腦組織做對照,AJAP1基因在膠質瘤標本和惡性膠質瘤細胞系

10、中存在低表達,與腫瘤級別呈負相關,提示AJAP1可能作為抑癌基因參與膠質瘤的發(fā)生與發(fā)展。
　　2.應用AJAP1重組腺病毒載體轉染人腦膠質瘤U87和U251細胞后,可有效抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力,細胞免疫熒光提示在人腦膠質瘤細胞中過表達AJAP1后,可能通過對細胞骨架的重建、絲狀偽足的減少,從而降低膠質瘤細胞侵襲、遷移能力。
　　3.成功建立U87細胞顱內膠質瘤模型,在體內進一步證實了AJAP1的抑瘤作用,與體外實