SH3GL2基因在喉癌中的功能及調(diào)控機制的研究.pdf

1、本文研究了SH3GL2基因的功能及其在信號傳導通路中的調(diào)控機制。 研究方法： 應(yīng)用真核表達載體和特異性siRNA轉(zhuǎn)染得到SH3GL2基因高表達和低表達的Hep2細胞模型，檢測SH3GL2基因表達異常對Hep2細胞的增殖能力、凋亡情況和侵襲能力等生物學性狀的影響，進一步了解．SH3GL2基因在喉癌發(fā)生中可能發(fā)揮的作用。構(gòu)建SH3GL2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠以進一步研究該基因在生物體內(nèi)的作用及建立小鼠抗腫瘤模型。通過熒光報告基因分

2、析SH3GL2基因5’旁側(cè)序列，以確定SH3GL2基因啟動子區(qū)和調(diào)控元件。應(yīng)用EMSA和免疫共沉淀等技術(shù)進一步研究該基因的上下游調(diào)控機制和其可能在細胞信號轉(zhuǎn)導通路中的位置。 研究結(jié)果： 1、真核表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染成功地構(gòu)建了SH3GL2基因真核表達載體并轉(zhuǎn)染喉癌Hep2細胞系，通過RT-PCR和Western blot驗證得到了SH3GL2基因高表達的Hep2細胞模型。 2、特異性siRNA合成及轉(zhuǎn)染成功地設(shè)計并

3、合成了SH3GL2基因特異性的siRNA并轉(zhuǎn)染喉痛Hep2細胞系，通過RT-PCR和Western blot驗證得到了SH3GL2基因低表達的Hep2細胞模型。 3、細胞增殖能力的檢測應(yīng)用MTT法分別檢測了SH3GL2基因高表達和低表達的Hep2細胞模型，發(fā)現(xiàn)在SH3GL2基因高表達時實驗組細胞的增殖能力下降明顯(P<0.05)，而低表達時增殖能力升高(P<0.05)。 4、細胞凋亡水平的檢測應(yīng)用Anexin V和PI雙

4、標法通過流式細胞儀檢測了SH3GL2基因高表達和低表達的Hep2細胞模型，發(fā)現(xiàn)在SH3GL2基因高表達時實驗組細胞的凋亡水平有明顯提升(P<0.05)，而低表達時則有一定程度的降低(P<0.05)。 5、細胞侵襲能力的檢測應(yīng)用Transwell小室檢測SH3GL2基因高表達和低表達對喉癌侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)在SH3GL2基因高表達時實驗組細胞的侵襲能力有明顯降低(P<0.05)，而低表達時無明顯變化(P>0.05)。 6

5、、轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建和鑒定構(gòu)建SH3GL2基因轉(zhuǎn)基因小鼠，應(yīng)用PCR和Southern blot方法鑒定并獲得7只FO代小鼠。 7、SH3GL2基因啟動子區(qū)的克隆及活性分析分析克隆并定位SH3GL2基因5’旁側(cè)序列。通過熒光素酶報告基因系統(tǒng)確定SH3GL2基因啟動子的范同，并發(fā)現(xiàn)SH3GL2基因5’旁側(cè)序列中2個具有明顯調(diào)控作用的區(qū)域。應(yīng)用EMSA實驗證實NF-κB與SH3GL2基因5’旁側(cè)序列特異性結(jié)合。 8、免疫沉淀實

6、驗發(fā)現(xiàn)SH3GL2相互作用蛋白通過免疫沉淀發(fā)現(xiàn)有兩個蛋白質(zhì)與SH3GL2相互作用，其中一個明確為SP100蛋白。 9、SP100基因和SH3GL2基因表達改變對ETS-1基因表達的影響SP100基兇表達下調(diào)時，ETS-1基因的表達也同時下調(diào)；而當SH2GL2基因表達升高時，ETS-1基因的表達也呈現(xiàn)降低趨勢(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、首次證實SH3GL2基因與喉鱗癌相關(guān)，并在喉痛組織巾表達下調(diào)。

7、2、首次證實SH3GL2基因?qū)戆〩ep2細胞多種重要的生物學行為如增殖能力、凋亡和侵襲能力有調(diào)節(jié)作Hj，可能是喉癌一個潛在的腫瘤抑制基因。 3、構(gòu)建并鑒定得到了FO代SH3GL2基因轉(zhuǎn)基因小鼠。 4、確定SH3GL2基因啟動子的范圍，并明確．SH3GL2基因5’旁側(cè)序列2個具有明顯調(diào)控作用的區(qū)域。 5、證實NF-κB與SH3GL2基因5’旁側(cè)序列結(jié)合的特異性。 6、應(yīng)用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)了