SH3GL2基因在喉癌中的功能及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、本文研究了SH3GL2基因的功能及其在信號(hào)傳導(dǎo)通路中的調(diào)控機(jī)制。 研究方法： 應(yīng)用真核表達(dá)載體和特異性siRNA轉(zhuǎn)染得到SH3GL2基因高表達(dá)和低表達(dá)的Hep2細(xì)胞模型，檢測(cè)SH3GL2基因表達(dá)異常對(duì)Hep2細(xì)胞的增殖能力、凋亡情況和侵襲能力等生物學(xué)性狀的影響，進(jìn)一步了解．SH3GL2基因在喉癌發(fā)生中可能發(fā)揮的作用。構(gòu)建SH3GL2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠以進(jìn)一步研究該基因在生物體內(nèi)的作用及建立小鼠抗腫瘤模型。通過熒光報(bào)告基因分

2、析SH3GL2基因5’旁側(cè)序列，以確定SH3GL2基因啟動(dòng)子區(qū)和調(diào)控元件。應(yīng)用EMSA和免疫共沉淀等技術(shù)進(jìn)一步研究該基因的上下游調(diào)控機(jī)制和其可能在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的位置。 研究結(jié)果： 1、真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染成功地構(gòu)建了SH3GL2基因真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染喉癌Hep2細(xì)胞系，通過RT-PCR和Western blot驗(yàn)證得到了SH3GL2基因高表達(dá)的Hep2細(xì)胞模型。 2、特異性siRNA合成及轉(zhuǎn)染成功地設(shè)計(jì)并

3、合成了SH3GL2基因特異性的siRNA并轉(zhuǎn)染喉痛Hep2細(xì)胞系，通過RT-PCR和Western blot驗(yàn)證得到了SH3GL2基因低表達(dá)的Hep2細(xì)胞模型。 3、細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)應(yīng)用MTT法分別檢測(cè)了SH3GL2基因高表達(dá)和低表達(dá)的Hep2細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)在SH3GL2基因高表達(dá)時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力下降明顯(P<0.05)，而低表達(dá)時(shí)增殖能力升高(P<0.05)。 4、細(xì)胞凋亡水平的檢測(cè)應(yīng)用Anexin V和PI雙

4、標(biāo)法通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)了SH3GL2基因高表達(dá)和低表達(dá)的Hep2細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)在SH3GL2基因高表達(dá)時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡水平有明顯提升(P<0.05)，而低表達(dá)時(shí)則有一定程度的降低(P<0.05)。 5、細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)SH3GL2基因高表達(dá)和低表達(dá)對(duì)喉癌侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)在SH3GL2基因高表達(dá)時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲能力有明顯降低(P<0.05)，而低表達(dá)時(shí)無明顯變化(P>0.05)。 6

5、、轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建和鑒定構(gòu)建SH3GL2基因轉(zhuǎn)基因小鼠，應(yīng)用PCR和Southern blot方法鑒定并獲得7只FO代小鼠。 7、SH3GL2基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆及活性分析分析克隆并定位SH3GL2基因5’旁側(cè)序列。通過熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)確定SH3GL2基因啟動(dòng)子的范同，并發(fā)現(xiàn)SH3GL2基因5’旁側(cè)序列中2個(gè)具有明顯調(diào)控作用的區(qū)域。應(yīng)用EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)NF-κB與SH3GL2基因5’旁側(cè)序列特異性結(jié)合。 8、免疫沉淀實(shí)

6、驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SH3GL2相互作用蛋白通過免疫沉淀發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)蛋白質(zhì)與SH3GL2相互作用，其中一個(gè)明確為SP100蛋白。 9、SP100基因和SH3GL2基因表達(dá)改變對(duì)ETS-1基因表達(dá)的影響SP100基兇表達(dá)下調(diào)時(shí)，ETS-1基因的表達(dá)也同時(shí)下調(diào)；而當(dāng)SH2GL2基因表達(dá)升高時(shí)，ETS-1基因的表達(dá)也呈現(xiàn)降低趨勢(shì)(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、首次證實(shí)SH3GL2基因與喉鱗癌相關(guān)，并在喉痛組織巾表達(dá)下調(diào)。

7、2、首次證實(shí)SH3GL2基因?qū)戆〩ep2細(xì)胞多種重要的生物學(xué)行為如增殖能力、凋亡和侵襲能力有調(diào)節(jié)作Hj，可能是喉癌一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因。 3、構(gòu)建并鑒定得到了FO代SH3GL2基因轉(zhuǎn)基因小鼠。 4、確定SH3GL2基因啟動(dòng)子的范圍，并明確．SH3GL2基因5’旁側(cè)序列2個(gè)具有明顯調(diào)控作用的區(qū)域。 5、證實(shí)NF-κB與SH3GL2基因5’旁側(cè)序列結(jié)合的特異性。 6、應(yīng)用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)了