位點特異性重組系統(tǒng)在甘藍型油菜中的建立.pdf

1、位點特異性重組技術(shù)是通過特異性重組酶對DNA特定序列進行準(zhǔn)確切割和重新連接,從而在基因或染色體水平上對生物進行遺傳改造的一種技術(shù)。位點特異性重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物基因的定點整合、基因刪除、多基因植物表達載體建立、多基因疊加、遺傳育種等方面都有十分重要的意義。
　　 本實驗選用Cre／loxP和FLP／FRT兩個位點特異性重組系統(tǒng),以GFP(綠色熒光蛋白)為報告基因成功構(gòu)建了兩個表達載體Z1與Cer40,用于在甘藍型油菜中建立Cre

2、／loxP及FLP／FRT兩個位點特異性重組系統(tǒng)。在轉(zhuǎn)基因成苗實驗過程中,采用農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化植株,摸索了卡納霉素抗性篩選的最佳濃度,以下胚軸和子葉柄為外植體的再生體系經(jīng)過共培培養(yǎng)、延遲培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)及生根培養(yǎng)等植物組織培養(yǎng)過程成功轉(zhuǎn)化了12棵Z1載體陽性苗和3棵Cer40載體陽性苗。
　　 本實驗還就實驗過程中由于一些染菌和移栽失敗,造成一些陽性苗瀕臨滅絕的問題摸索了一整套以葉片為外植體再生成苗的體系。并應(yīng)用在了稀缺苗上,成功

3、得到了大量再生苗,解決了此項問題。
　　 后期成苗檢測研究過程中,用普通PCR方法在油菜基因組中檢測到卡納抗性基因,初步判斷為轉(zhuǎn)基因植株。通過以CRE酶基原因探針進行PCR-southern bolt雜交分析,分析結(jié)果顯示有明顯的預(yù)期信號出現(xiàn),進一步表明表達載體已經(jīng)整合到油菜染色體中。通過半定量法在RNA水平上檢測到了Cre基因的表達,并得出了每個植株表達量的差異。這不僅證實了位點特異性重組系統(tǒng)成功的在甘藍型油菜中表達,同時也為