表達HCV NS3蛋白肝細胞中ERK與NF-κB、JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的cross-talk研究.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤，流行病學(xué)研究顯示肝炎病毒感染、黃曲霉毒素的攝入及酗酒是其重要的致病因素。分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的深入研究，對HCC發(fā)生機制的闡明起到了重要的推動作用。丙型肝炎病毒(hepatitis virus C,HCV)是HCC的重要致病因子之一，持續(xù)的感染可導(dǎo)致慢性丙型肝炎，并可發(fā)展為肝硬化和肝細胞癌，其致癌機制尚不清楚。據(jù)統(tǒng)計，

2、目前全世界約有1.5億人口感染丙型肝炎病毒。 HCV是一種正鏈RNA病毒，無逆轉(zhuǎn)錄酶活性，只能在細胞胞漿內(nèi)復(fù)制，不能與宿主基因整合，主要是通過其表達的蛋白質(zhì)作用于宿主細胞發(fā)揮其致癌效用，其中HCVNS3、NS5和核心蛋白與HCC的發(fā)生關(guān)系尤為密切。 HCV NS3蛋白是含631個氨基酸(1026—1656)的胞漿蛋白。HCV NS3蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MH／3T3細胞后，細胞端粒酶活性顯著增高；本實驗小組前期研究證實HCV

3、 NS3蛋白N端多肽可以誘導(dǎo)QSG7701細胞株轉(zhuǎn)化，并接種裸鼠成瘤。這些結(jié)果均提示HCV NS3蛋白是HCV相關(guān)性HCC發(fā)生的重要因子。 腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多階段發(fā)展的過程，涉及細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多方面。尤其是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與疾病關(guān)系已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點和前沿，故本研究擬探討細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路在HCV NS3蛋白介導(dǎo)的細胞增殖中的作用機制，ERK 通路與NF-r.B、JAK／STAT通

4、路之間可能存在的cross-talk及其在肝細胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化中的作用。 HCV為嗜肝細胞病毒，其自然宿主是人或黑猩猩，利用轉(zhuǎn)基因鼠或非人源肝細胞作為研究體系，不能真實反映HCV感染的自然進程，所獲結(jié)果難以令人信服。本研究小組采用人源永生化肝細胞系QSG7701作為實驗對象，將表達HCV NS3蛋白的真核細胞表達質(zhì)粒 (pcDNA3.l-NS3)轉(zhuǎn)染人肝細胞系QSG7701，建立穩(wěn)定表達HCV NS3蛋白的細胞系QSG7701

5、／NS3，李波博士成功進行了鑒定。本實驗采用OSG7701、pcDNA3.l／QSG7701以及QSG7701／NS3①②③五組細胞，Western blot檢測HCV NS3蛋白對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。結(jié)果顯示QSG7701／NS3細胞中磷酸化的P38<'MAPK>和JNK的表達水平與pcDNA3.1／QSG7701和QSG7701細胞無明顯差異，但磷酸化的ERK(P44／42<'MAPK>)表達水平明顯升高，提示HCV NS3

6、蛋白可能通過增強ERK(P44／42<'MAPK>)的磷酸化而促進肝細胞的增殖，從而在HCC發(fā)生中起作用。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終均通過核轉(zhuǎn)錄因子(如AP-1、NF-κB、STAT3)作用于細胞基因組調(diào)節(jié)細胞生物學(xué)行為。本實驗小組前期結(jié)果顯示HCV NS3蛋白上調(diào)AP-1、NF-κB、STAT3的DNA活性。本實驗檢測了HCV NS3蛋白對cyclinDl表達水平的影響，結(jié)果顯示QSG7701／NS3細胞cyclinDl表達水平明顯高于ncDN

7、A3.1／QSG7701和QSG7701細胞。我們推測HCV NS3蛋白促進QSG7701細胞增殖可能通過激活ERK／AP-1級聯(lián)，繼而上調(diào)cyclinDl實現(xiàn)的。 為了進一步闡明HCV NS3蛋白通過ERK(P44／42<'MAPK>)信號通路的促細胞增殖作用，觀察ERK與NF-κB、JAK／STAT信號途徑間是否存在cross-talk以及它們在肝細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中作用，我們采用ERK激酶MEK的抑制劑PD98059(OμM

8、、30μM、50μM、100μM)處理QSG7701／NS3細胞，利用Western blot檢測ERK的磷酸化及cvclinDl的表達水平；凝膠電泳阻滯遷移試驗(EMSA)檢測AP-1、NF-κB、STAT3轉(zhuǎn)錄因子活性的改變；流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞各周期百分數(shù)的改變；MTT比色法觀察對細胞增殖的影響。結(jié)果：PD98059處理QSG7701／NS3后，其ERK磷酸化水平和cyclinDl表達水平明顯降低；同時，AP-1、NF-κ