豬瘟病毒主要抗原蛋白在畢赤酵母和大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、豬瘟病毒(Classical swine fevev virus,CSFV)是引起豬的高度傳染性疾病豬瘟(Classical swine feve,CSF)的病原,E2和<'rns>蛋白是其主要的保護(hù)性抗原蛋白,也是CSF亞單位標(biāo)記疫苗研制的主要對象.為了探索利用基因工程方法大量生產(chǎn)CSF主要抗原蛋白的可能性,本試驗(yàn)開展了CSFV E<'rns>和E2蛋白的體外表達(dá)研究.利用RT-PCR和nPCR方法從中國兔化弱毒株(C-株)兔脾組織毒

2、中擴(kuò)增得到E<'ms>/E1/E2基因片段,然后將其克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pPSWE.經(jīng)SalI酶線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞,利用G418抗生素篩選高拷貝重組子.加入0.5﹪的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,離心收集誘導(dǎo)物上清,硫酸銨沉淀濃縮,透析后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析.結(jié)果表明,E<'ms>/E1/E2在畢赤酵母中得到了表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分子量約為89ku,

3、能夠與CSFV陽性血清發(fā)生特異反應(yīng).為了提高E2蛋白的表達(dá)水平,將E2基因單獨(dú)克隆到原核表達(dá)載體PGEX4T-1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGST-E2,轉(zhuǎn)入到宿主菌BL21(Star)中,并利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).SDS-PAGE和Western blotting分析的結(jié)果顯示,E2蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在.為了提高可溶性蛋白在表達(dá)產(chǎn)物中的比例,在較低的溫度和IPTG濃度下對重組菌進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá).結(jié)果表明,