ω-3脂肪酸后處理對大鼠缺血再灌注心肌抗氧化作用的影響.pdf

1、1、背景
　　 缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusioninjury，IRI)是指缺血期處于可逆損傷的組織細胞經恢復血液再灌注后，損傷加重或轉化為不可逆性損傷。隨著臨床心臟外科體外循環(huán)手術及冠脈內溶栓、經皮穿刺冠狀動脈腔內介入治療(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)的廣泛開展，心肌IRI已成為一個普遍的臨床問題，愈來愈引起心臟?？漆t(yī)生的重視。IRI是

2、一個涉及多種機制的復雜病理生理過程，一般認為主要有以下幾種作用機制:1、自由基反應;2、細胞內鈣超載;3、白細胞積聚;4、高能磷酸化合物缺乏;5、無復流現(xiàn)象等等。1986年Murry等發(fā)現(xiàn)狗心臟多次短暫的缺血可以減輕隨后較長時間的缺血再灌注帶來的心肌損傷，由此提出缺血預處理(ischemicpreconditioning，IPC)的概念，認為心肌IPC可以提高心肌細胞自身抗損傷的耐受性或適應性，減輕心肌IRI。后來大量的實驗研究也印證了

3、心肌IPC可以起到明確的心肌保護作用。但由于這種預處理需要在發(fā)生缺血前進行，使其臨床應用價值大大受限。盡管心肌保護已經發(fā)展了多年，但現(xiàn)有的心肌保護措施大部分都屬于針對擇期心臟手術的預防性保護，而心臟?？频奶攸c就是起病的突然性和嚴重性(如急性心肌梗死或急診心臟手術)，對于此類病人，發(fā)病時其心臟功能往往已經很差，而手術治療不可避免的會產生心肌IRI，導致其心臟功能進一步惡化，所以心肌保護的意義顯得尤為重要，但面對這樣的情況大部分傳統(tǒng)的心肌保

4、護措施因為失去了應用的時機而顯得作用有限。針對已缺血心肌，如何設法減輕再灌注損傷，成為心肌保護研究的一個難點。2003年Zhao等發(fā)現(xiàn)心肌缺血后在再灌注前進行短暫的心肌缺血再灌注也能對抗隨后的心肌IRI，并能起到和IPC同樣的心肌保護效果，于是提出了缺血后處理(ischemicpostconditioning，IP)的概念，為IRI的防治提供了一個新的思路及方向。后處理作用機制涉及活性氧(reactiveoxygenspecies，RO

5、S)、內源性自身激活物、線粒體ATP敏感性鉀通道、一氧化氮、再灌注損傷補救激酶途徑(reperfusioninjurysalvagekinases，RISK)、線粒體通透性轉換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)等多方面作用。研究發(fā)現(xiàn)對已缺血的心肌于再灌注開始時給予適量藥物，可產生類似于后處理的心肌保護作用，即藥物模擬后處理。而藥物模擬后處理的可操作性明顯強于常規(guī)意義上的IP，因

6、此具有更為廣泛的應用前景。已有學者將其應用于臨床，并取得了較好的心肌保護效果。但目前文獻報道用于模擬后處理的藥物并不多，主要有腺苷、阿片類物質、揮發(fā)性麻醉藥物等，且由于藥物本身的副作用(如阿片類物質)或藥物本身的特點(如揮發(fā)性麻醉藥物)，使其臨床應用受到了較大的限制;而腺苷只是從改善心肌細胞能量代謝方面發(fā)揮一定的作用，作用途徑較單一。尋找更加安全有效、便于臨床應用的IP藥物，無疑具有重要的臨床實用價值。
　　 ω-3脂肪酸屬于多

7、不飽和脂肪酸，主要包括α-亞麻酸、二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)等。近年來，ω-3脂肪酸的心臟保護作用引起了越來越多的重視。大規(guī)模的臨床試驗證明每日攝入500mg到1000mg的多不飽和脂肪酸可顯著的減少心血管事件的發(fā)生幾率。研究表明，ω-3脂肪酸具有免疫調節(jié)功能、抑制炎癥反應、抗心律失常及抗血栓的作用。眾所周知，心臟手術體外循環(huán)過程中血

8、液直接接觸異物表面、手術創(chuàng)傷，器官缺血再灌注導致白細胞與內皮細胞激活、體溫變化、腸道內毒素釋放等均可引發(fā)全身炎癥反應綜合征，炎性細胞因子、補體、中性粒細胞相繼被激活，造成術后心功能受損，全身重要器官功能不良。因此，ω-3脂肪酸可以通過抑制全身及局部的炎癥反應達到保護心臟功能的作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)ω-3脂肪酸還可通過作用于心肌細胞的離子通道、離子泵、交換體及影響細胞膜的穩(wěn)定、氧化應激等發(fā)揮其心肌保護的作用。ω-3脂肪酸以游離脂肪酸形式直

9、接溶于細胞漿膜磷脂易感應的疏水性內側面，可降低細胞膜電興奮性，一定程度上起到細胞膜電穩(wěn)定的作用;同時心肌細胞膜磷脂的ω-3脂肪酸含量增加，使ω-6脂肪酸含量相對減少，能增加膜穩(wěn)定性，并影響心肌細胞的各種離子通道、交換體等，最終減輕心肌IRI。亦有研究報道ω-3脂肪酸可以減少心肌耗氧量，減少心肌缺血再灌注時氧化應激及K+的丟失，從而減少再灌注性心律失常。在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，ω-3脂肪酸可增加血漿氧化脂質復合物和超活性氧化物的濃度，其中包括自

10、由基和過氧化物酶等，有學者認為這相當于激活了人體的生存信號傳導通路而達到了IPC的效果，從而效地減輕了發(fā)生心肌梗死或體外循環(huán)時缺血再灌注對心肌細胞的損傷。研究還發(fā)現(xiàn)ω-3脂肪酸可以調節(jié)新生鼠心肌細胞的相關下游基因表達從而調節(jié)炎癥反應、細胞基質的重構、鈣離子的釋放和超活性氧化反應物的生成，這可能是ω-3脂肪酸發(fā)生心肌保護作用的重要機制。McGuinness等在新西蘭白兔心肌缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，ω-3脂肪酸預處理還可以誘導心肌細胞熱休克蛋

11、白(heatshockprotein，HSP)的大量表達，降低了心肌梗死面積。但目前對ω-3脂肪酸的研究大部分都還是集中在其預處理對心肌的保護作用。聯(lián)系到心肌IRI的幾種發(fā)病機制，我們看到，ω-3脂肪酸在這幾個方面都可能發(fā)揮作用，減輕心肌IRI，有希望作為一種安全有效的IP藥物應用于臨床心肌IRI的防治。
　　 2、目的
　　 利用離體大鼠心臟缺血再灌注模型，研究ω-3脂肪酸后處理是否能提高離體大鼠心臟缺血再灌注期間的抗

12、氧化能力，并通過對心肌細胞梗死面積及線粒體超微結構損害程度的比較來判斷ω-3脂肪酸后處理是否能產生有效的心肌保護作用，探討其可能的作用機制，為尋找一種可安全有效地應用于臨床心肌IRI防治的藥物提供理論及實驗依據。
　　 3、材料與方法
　　 3.1、建立Langendorff離體大鼠心臟缺血再灌注模型
　　 3.2、實驗動物分組:SPF級雄性SD大鼠60只，隨機分為4組，每組15只
　　 3.2.1、持續(xù)

13、灌注組(A組):持續(xù)灌注150min;
　　 3.2.2、缺血再灌注組(B組):灌注30min，缺血30min后再灌注90min;
　　 3.2.3、缺血后處理組(C組):灌注30min，缺血30min后再灌注90min，在再灌注開始前進行4個循環(huán)復灌20s/缺血20s;
　　 3.2.4、ω-3脂肪酸后處理組(D組):灌注30min，缺血30min后再灌注90min，在再灌注開始前用ω-3脂肪酸的靜脈制劑ω-3

14、魚油脂肪乳灌注15min，ω-3魚油脂肪乳的終濃度為1:400(v/V)。
　　 3.3、觀察指標及方法
　　 3.3.1、每組各取5只大鼠取左心室游離壁心肌組織檢測灌流結束后心肌細胞氧化損傷和抗氧化指標:考馬斯亮蘭法測蛋白含量，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)采用黃嘌呤氧化酶法測定，丙二醛(malondialdehyde，MDA)采用硫代巴比妥酸法測定，乳酸脫氫酶(lactatedehy

15、drogenase，LDH)采用可見光分光光度計法測定;
　　 3.3.2、每組各取5只大鼠將心臟由心尖部向心底部切成1mm厚的薄片，TTC染色后存活心肌呈磚紅色，梗死區(qū)不著色呈灰白色，置于玻片上，拍照后以ImageJ1.37軟件計算心肌梗死面積百分比;
　　 3.3.3、灌流結束后每組各取5只大鼠心臟心尖部組織進行處理并利用電子顯微鏡觀察心肌細胞線粒體超微結構的形態(tài)及損傷程度。
　　 4、結果
　　 4

16、.1、與A組比較，心肌缺血再灌注后B、C、D組大鼠心肌細胞的LDH及MDA升高(P＜0.05)，SOD降低(P＜0.05)。與B組比較，C組的SOD雖然有所升高，MDA有所降低，但與B組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.165、P=0.056);而與B組比較，D組的SOD升高及MDA、LDH降低均有統(tǒng)計學意義(P=0.049、P=0.049、P=0.000)。
　　 4.2、各組心肌梗死面積百分比為:A組(11.14±3.09)

17、％，B組(34.15±3.06)％，C組(26.94±2.73)％，D組(23.28±2.60)％。與B組比較，A組、C組及D組減少大鼠心肌梗死面積結果有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.007，P=0.000)，C組與D組組間比較無明顯差異性(P=0.368)。
　　 4.3、將不同處理組的大鼠心肌組織置于透射電鏡下放大11500倍觀察，可見A組大鼠心肌線粒體體積基本正常，包膜完整，嵴排列整齊、連續(xù)，基質密度正常，肌纖維無明

18、顯水腫、斷裂;B組心肌細胞線粒體大量腫脹變形，嵴數(shù)量明顯減少，斷裂、溶解成空泡狀，線粒體基質電子密度降低，部分線粒體基質濃縮，電子密度加深而線粒體體積變小，肌纖維斷裂、溶解;C組線粒體結構和B組相比病變有所改善，但仍有部分線粒體腫脹變形，嵴斷裂，部分線粒體內有空泡形成;D組的損傷進一步減輕，大部分線粒體正常，僅見個別線粒體輕度腫脹、嵴數(shù)量減少，無明顯斷裂、溶解。
　　 5、結論
　　 ω-3脂肪酸后處理可有效提高離體大鼠