卷柏總黃酮及穗花杉雙黃酮對TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用研究.pdf

1、　　目的 探討卷柏總黃酮(Total Flavonoids of Selaginella Tamariscina,TFST)及穗花杉雙黃酮(Amentoflavone,AMT)對損傷的血管內皮細胞的保護作用及其作用機制,并比較二者對血管內皮保護作用的強弱。
　　方法 1.選擇體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC)為研究對象,建立腫瘤壞死因子(

2、tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)誘導HUVEC細胞復制血管內皮細胞(vascular endothelial cell,VEC)損傷模型。
　　2.MTT法確定TFST和AMT作用于HUVEC細胞的量效、時效,并檢測TFST和AMT對HUVEC細胞增殖的影響,同時采用流式細胞術檢測TFST和AMT對HUVEC細胞周期的影響來探討增殖機制。
　　3.在誘導模型及藥物作用量效、時效都已

3、確定的基礎上,采用MTT法檢測TFST和AMT對TNF-α誘導HUVEC細胞增殖的影響,通過硝酸還原酶法檢測NO及酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測ET-1來探討TFST和AMT對內皮的保護作用；檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)來探討藥物的抗氧化作用。
　　4.通過ELISA法檢測炎癥相關因子與氧化損傷相關因子并作相關性分析；采用ELISA法和免疫印跡法(Western-blotting)檢測粘附因子VCAM-1

4、、E-selectin,炎癥因子IL-6、IL-8蛋白的表達來探討TFST和AMT對血管內皮炎癥損傷的保護作用。
　　5.通過Western-blotting法檢測IκBα、胞核NF-κBp65蛋白表達以及采用激發(fā)光共聚焦顯微鏡技術檢測NF-κBp65的核遷移情況來探討TFST和AMT對NF-κB信號通路的影響。
　　6.采用上述所有方法,檢測TFST和AMT對血管內皮損傷的保護作用。
　　結果 1.經查閱

5、文獻TNF-α作用的最佳劑量為10 ng·mL-1,ELISA法檢測VCAM-1、E-selectin結果顯示：TNF-α作用的最佳作用時間是24h(p<0.01)。
　　2.MTT 實驗結果顯示：TFST 的最佳作用時間是 36h,有效劑量是 5μg·mL-1、10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1；AMT的最佳作用時間是12h,有效劑量為2μg·mL-1、4μg·mL-1、6μg·mL-1、8μg·mL

6、-1(p<0.01)。對HUVEC細胞增殖結果顯示：與正常組相比較,TFST 濃度為 5μg·mL-1、10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1 及 AMT 濃度為2μg·mL-1、4μg·mL-1、6μg·mL-1、8μg·mL-1時細胞存活率極顯著性增高(p<0.01)。流式細胞術結果顯示：與正常組相比,TFST 濃度為 5μg·mL-1、10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1及AMT濃度為2μ

7、g·mL-1、4μg·mL-1、6μg·mL-1、8μg·mL-1使S期細胞百分比顯著性增加(p<0.01)。
　　3.對TNF-α誘導HUVEC細胞增殖結果顯示：與正常組相比,模型組細胞存活率(%)明顯降低；與模型組相比較,TFST及AMT不同濃度時細胞存活率(%)明顯增高(p<0.01)。檢測NO和ET-1結果顯示：與正常組相比,模型組NO含量顯著性降低, ET-1 的含量顯著性升高(p<0.01)；與模型組相比,卷柏總黃

8、酮和穗花杉雙黃酮各劑量組均可使NO含量顯著性升高,ET-1含量顯著性降低(p<0.01)。SOD和MDA結果顯示：與正常組相比,模型組 SOD 顯著性降低,MDA 極顯著性增高(p<0.01),卷柏總黃酮和穗花杉雙黃酮各劑量組能顯著性提高SOD活力,降低MDA水平(p<0.01)。
　　4.相關性分析表明：在TNF-α誘導損傷的HUVEC細胞損傷的細胞模型中,SOD與 VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8 呈

9、顯著性負相關(r=-0.870,-0.97-0.990,-0.937)；MDA與VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8呈顯著性正相關(r=0.850,0.623,0.782,0.693)。檢測炎癥因子和粘附因子結果顯示：與正常組相比,模型組VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8 的含量顯著性升高(p<0.01)；與模型組相比,卷柏總黃酮組和穗花杉雙黃酮組均可使VCAM-1、E-selectin、IL-6、

10、IL-8含量顯著性降低(p<0.01)。Western-blotting結果顯示：與正常組相比,模型組VCAM-1、E-selectin蛋白表達上調(p<0.01)；與模型組相比,卷柏總黃酮組和穗花杉雙黃酮組均可使VCAM-1、E-selectin蛋白表達顯著性的下調(p<0.01)。
　　5.對NF-κB信號通路結果顯示：與正常組相比,模型組IκBα蛋白表達顯著性下調,胞核蛋白NF-κBp65表達顯著性上調(p<0.01)；

11、與模型組相比,卷柏總黃酮和穗花杉雙黃酮均可顯著性的上調IκBα蛋白表達,使胞核蛋白NF-κBp65表達顯著性下調(p<0.01)。CLSM結果顯示：隨著TFST和AMT濃度的增加,熒光由黃色到橘色,提示NF-κBp65從胞漿遷移進入胞核量的由多到少,即NF-κB的活性強度逐漸減弱。
　　6.TFST和AMT在最佳劑量和最佳作用時間的條件下對HUVEC保護作用進行對比研究,從檢測NO/ET-1、SOD/MDA、VCAM-1、E-

12、selectin、IL-6、IL-8蛋白的表達以及NF-κBp65的核遷移的情況的結果顯示：與正常組相比,模型組NO降低、ET-1增加、SOD活力降低、MDA含量增加、VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8蛋白表達上調(p<0.01),免疫熒光疊加顯黃色；與模型組相比,卷柏總黃酮及穗花杉雙黃酮均可顯著性的增加 NO、減少 ET-1、增加 SOD 活力、降低 MDA 含量、下調 VCAM-1、E-selectin、IL-6

13、、IL-8蛋白表達(p<0.01)、免疫熒光疊加由黃色到橘色,且卷柏總黃酮的作用強度強于穗花杉雙黃酮。
　　結論 1. TFST和AMT對HUVEC的保護作用可能是通過上調NO分泌、下調ET-1的表達,進而改善血管內皮功能來實現(xiàn)的。
　　2. TFST和AMT對HUVEC的保護作用機制可能與①抗氧化損傷；②抑制NF-κB信號通路的激活；③抑制NF-κB信號通路調控的下游粘附因子VCAM-1、E-selectin,炎癥