烏司他丁對(duì)失血性休克大鼠肺細(xì)胞間粘附分子-1的影響及其肺保護(hù)作用.pdf

1、當(dāng)機(jī)體受到各種嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、失血、休克、燒傷、胰腺炎及再灌注損傷等因素刺激時(shí)，可以形成全身炎癥反應(yīng)綜合癥（Systemic Inflammatorome syndrome-SIRS），在這種情況下，即使原發(fā)因素消除或減弱，炎癥反應(yīng)仍可繼續(xù)并最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合癥（Multiple Organ Dysfunction Syndrome-MODS）。其中呼吸功能障礙在MODS中發(fā)病率高，出現(xiàn)時(shí)間早，一般在發(fā)病后24-72h，臨床表現(xiàn)

2、為急性肺損傷（Acute Lung Injury-ALI）和急性呼吸窘迫綜合癥（Acute Respiratory Distress-ARDS），發(fā)生率高達(dá)40%-80%。ALI的治療目標(biāo)包括：改善肺氧合功能，糾正缺氧，生命支持，保護(hù)器官功能，預(yù)防并發(fā)癥和治療基礎(chǔ)疾病。失血性休克由于機(jī)體有效循環(huán)血量驟然減少和組織低灌注，及隨后的缺血/再灌注損傷可導(dǎo)致ALI，作為l臨床常見急癥受到越來(lái)越多的關(guān)注。既往的研究表明，白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞（P

3、olymorphonuclear neutrophil-PMN）既是引發(fā)SIRS的主要細(xì)胞，又是缺血/再灌注損傷主要參與者，成為介導(dǎo)休克后肺損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞，與內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cell-EC）上粘附分子的粘附過(guò)程構(gòu)成了損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-ICAM-1）是EC上免疫球蛋白超家族成員，其表面受體可與PMN上整合素配體結(jié)合。正常情況下

4、其表達(dá)和活化受到限制，在刺激因素（IL-1、TNF、LPS）作用下表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的ICAM-1一方面促進(jìn)PMN的粘附，導(dǎo)致PMN跨血管內(nèi)皮、釋放活性物質(zhì)造成組織損傷。另一方面促發(fā)炎癥介質(zhì)的“瀑布樣”釋放。細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)進(jìn)一步吸引和激活PMN釋放更多的蛋白酶和自由基，構(gòu)成一個(gè)級(jí)聯(lián)放大的網(wǎng)絡(luò)，形成惡性循環(huán)，因而ICAM-1成為粘附過(guò)程的關(guān)鍵分子。 因此，如何早期抑制粘附分子的激活，減弱PMN的趨化、黏附、釋放活性物質(zhì)減輕機(jī)體

5、炎癥反應(yīng)、防止EC的損傷，從而預(yù)防ALI的發(fā)生發(fā)展，成為近年來(lái)人們關(guān)注的主要目標(biāo)之一。 烏司他?。║linary Trypsin Inhibitor-UTI）是一種來(lái)源于人體的高效廣譜蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、纖溶酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制作用。UTI本身來(lái)源于人體，無(wú)免疫原性，安全性高，是一種較理想的外源性蛋白酶抑制劑，早期被廣泛應(yīng)用于急性胰腺炎的治療，其器官保護(hù)作用的研究逐漸成為熱點(diǎn)。在對(duì)于UTI的基礎(chǔ)研究中，采

6、用的動(dòng)物模型主要集中在油酸、內(nèi)毒素、胃液吸入、急性胰腺炎等。臨床研究主要是針對(duì)細(xì)胞因子的變化來(lái)觀察其器官保護(hù)作用。有關(guān)UTI對(duì)失血性休克所致肺損傷的作用研究較少。蔣龍?jiān)热搜芯堪l(fā)現(xiàn)，UTI可抑制炎癥介質(zhì)的釋放而對(duì)缺血/再灌注損傷肺起保護(hù)作用。王剛等人在兔創(chuàng)傷失血性休克研究中，采集了休克前、休克中、復(fù)蘇后2h、4h靜脈血測(cè)定細(xì)胞因子（TNF-a，IL-6）和可溶性細(xì)胞見粘附分子-1（SICAM-1），結(jié)果顯示：創(chuàng)傷休克組TNF-a的變化大

7、于UTI組，且在復(fù)蘇后4h變化最明顯，2h后SICAM-1的變化在創(chuàng)傷休克組和UTI組均不明顯，但在復(fù)蘇后4h顯著升高，而UTI組又明顯高于創(chuàng)傷休克組。 本研究通過(guò)測(cè)定ICAM-I、MPO活力、肺組織W/D比，并觀察肺組織病理學(xué)變化，探討UTI對(duì)失血性休克大鼠ICAM-1的影響及其肺保護(hù)作用的可能機(jī)制。 材料和方法: 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組： 成年雄性大鼠24只，SPF級(jí)，體重350～450g，由廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)

8、動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、休克組（H組）和烏司他丁組（U組），每組8只。 2、動(dòng)物麻醉： 實(shí)驗(yàn)前12h禁食，自由飲水。30g/L戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉后仰臥位于手術(shù)臺(tái)上。術(shù)中以動(dòng)物出現(xiàn)體動(dòng)為麻醉清醒標(biāo)準(zhǔn)，以后每隔1小時(shí)股靜脈注射戊巴比妥鈉15mg/kg維持麻醉狀態(tài)。 3、失血性休克模型的建立： 待動(dòng)物麻醉后行股動(dòng)、靜脈穿刺并置管，動(dòng)脈用于監(jiān)測(cè)MAP和放血，靜脈用于回輸血液。C組僅行動(dòng)、靜脈穿

9、刺置管。另兩組上述操作完成后穩(wěn)定10nun，由股動(dòng)脈緩慢抽取血液2．0ml·（kg·min）-1（需10 min）至MAP（40±5）mmHg水平，并間斷回輸或放血維持此血壓60min建立失血性休克模型。U組復(fù)蘇開始前靜脈注入U(xiǎn)TI50000U/kg，H組輸入等量的生理鹽水，兩組均回輸全部失血和等量的乳酸林格液進(jìn)行復(fù)蘇（需30min）。復(fù)蘇后4h快速放血（約需2min）處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取肺組織。取左肺約100g投入液氮中，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰

10、箱凍存?zhèn)錂z。 4、指標(biāo)測(cè)定： 4．1、肺組織ICAM-1： 采用免疫組化法檢測(cè)：一抗為1：2001CAM-1單克隆抗體，二抗為辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG，陰性對(duì)照標(biāo)本除以PBS代替一抗外，其他步驟與被測(cè)標(biāo)本相同，陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒。在盲法下對(duì)切片進(jìn)行觀察并作半定量分析，根據(jù)細(xì)胞染色的深淺評(píng)分。無(wú)染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，深棕黃色3分。再以視野中顯色細(xì)胞所占的比例（取10個(gè)視野的平均值）評(píng)分：<20

11、%0分，20-40%1分，40～60%2分，>60%3分。將兩項(xiàng)評(píng)分的乘積作為積分?jǐn)?shù)，根據(jù)積分將ICAM-1表達(dá)分為四級(jí)：0分陰性，1～3分弱陽(yáng)性，4～6分陽(yáng)性，>6分強(qiáng)陽(yáng)性。 4．2、MPO檢測(cè)： 取凍存肺組織制成5%組織勻漿，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。用UV-2600A型紫外分光光度計(jì)在460 nm處通過(guò)比色測(cè)定該產(chǎn)物的生成量，依MPO活力單位/克濕片=（測(cè)定管OD-對(duì)照管OD）/（11．3×取樣量）公式推算出肺組織M

12、PO活力。 4.3、W/D比值測(cè)定： 取右肺上葉，濾紙吸干肺表面水分，精確稱重后放入烤箱72h（60℃），測(cè)定W/D比值； 4．4、肺組織病理學(xué)觀察： 取右肺中葉，多聚甲醛浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡（×200，×400）觀察肺組織病理學(xué)改變。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。體重、基礎(chǔ)血壓、放血量、MPO活力、

13、W/D比值，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，采用One-Way-ANOVA方法，方差不齊者采用welch法。多重比較采用LSD法或Dunnett's T3法。P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化積分值采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 三組動(dòng)物體重及基礎(chǔ)MAP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．730； P=0．859）。H組和U組放血量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．

14、850）。 1、ICAM-1： 方差齊性檢驗(yàn)顯示ICAM-1免疫組化積分值方差不齊，采用Welch法檢驗(yàn)，多重比較采用Dunnett．s T3法。各組ICAM-1免疫組化積分值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。C組肺泡間隔、血管EC表面和肺泡上皮細(xì)胞無(wú)染色，ICAM-1表達(dá)陰性，評(píng)分為0；U組肺泡間隔、血管EC和肺泡上皮細(xì)胞有黃色或棕黃色顆粒，肺組織ICAM-1表達(dá)呈弱陽(yáng)性（0，2，2，1，2，2，1，1）；H組肺泡間隔、血管EC和肺泡

15、上皮細(xì)胞均有棕黃色或深棕色顆粒，ICAM-1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。（評(píng)分4，6，2，4，6，9，6，6）（X2=19．966，P=0．000） 2、MPO活性： 方差齊性檢驗(yàn)顯示MPO活力值方差不齊，采用Welch法檢驗(yàn)，多重比較采用Dennett's T3法。C組MPO（1．60±0．8892）低于U組（2．14±0．18）和H組（2．72±0．21），U組低于H組，各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=86．874，P=0．00）。

16、 3、W/D比： 方差齊性檢驗(yàn)顯示W(wǎng)/D比值方差不齊，采用Welch法檢驗(yàn)，多重比較采用Dennett's T3法。C組W/D比（4．76±0．25）低于U組（5．20±0．27）和H組（5．51±0．20），U組低于H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19．223，P=0．00）。 4、光鏡觀察： C組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)無(wú)水腫、炎癥，肺泡大小形態(tài)均勻：H組肺組織彌漫性充血、出血，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，炎