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文檔簡介
1、人類疾病往往是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的結(jié)果,探討基因與環(huán)境的相互作用機制與規(guī)律,對于防治環(huán)境因素造成的機體危害具有重要意義。 為了進一步深入了解JWA基因與紅白血病的關系,本課題用hemin、熱應激及hemin與熱應激聯(lián)合處理K562細胞,觀察JWA基因在這些細胞模型中表達的特點和規(guī)律,探討JWA在細胞應答hemin和應激信號通路中的作用和分子機制,以期為發(fā)展新的物理療法與化療結(jié)合治療紅白血病提供依據(jù)。 一、JWA對h
2、emin處理K562細胞的應答:建立hemin誘導K562細胞向紅系分化的細胞模型:用不同濃度hemin處理K562細胞不同時間,以測定血紅蛋白的相對表達含量來確定細胞模型建立的成功。用RT-PCR方法檢測JWAmRNA表達變化;用Westernblot方法檢測JWA蛋白表達。 二、JWA基因?qū)釕ぬ幚鞬562細胞的應答:熱應激(42℃)處理K562細胞2h,K562細胞無明顯變化。用42℃水浴處理K562細胞不同時間(10、
3、30、45、60、90和120min),作用30min可使JWAmRNA水平表達顯著增加1.87±0.13倍;作用120min,JWA蛋白表達水平明顯增高7.00±1.73倍。 三、JWA基因?qū)emin與熱應激聯(lián)合作用K562細胞的應答:以30μMhemin處理K562細胞48h,然后42℃水浴30min,JWAmRNA表達雖有所增加,但低于hemin或熱應激的單獨處理時的表達水平。 四、JWA基因應答hemin和熱應
4、激的結(jié)構基礎:為了探討hemin和熱應激對JWA表達調(diào)節(jié)是否通過其激活的核轉(zhuǎn)錄因子與JWA基因啟動子反應元件結(jié)合而實現(xiàn)的,根據(jù)JWA基因啟動子所含有的不同的反應元件,分別構建的含JWA部分啟動子的P1、P2、P3以及pCAT質(zhì)粒。質(zhì)粒P1含有hemin和熱休克反應元件;質(zhì)粒P2僅含有熱休克反應元件,不含hemin反應元件;質(zhì)粒P3兩個反應元件均不包含。用無啟動子的空CAT質(zhì)粒pCAT作為對照質(zhì)粒,3種報告載體與參照質(zhì)粒β-gal按4∶1
5、的比例分別共轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染細胞6h后,加入hemin(終濃度為30μM)繼續(xù)培養(yǎng)48h,再42℃處理30min。經(jīng)hemin、熱應激單獨處理以及hemin和熱應激聯(lián)合作用后,質(zhì)粒P1、P2的轉(zhuǎn)錄活性均明顯高于對照。質(zhì)粒P1在hemin誘導處理后,其轉(zhuǎn)錄活性顯著增高,質(zhì)粒P2則不論單獨或聯(lián)合處理,其轉(zhuǎn)錄活性均升高。 五、JWA基因參與應答hemin和熱應激的相關信號通路:用MEK-1的抑制劑PD98059可以抑制hemin誘導K5
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