GINS2基因沉默對K562細胞和NB4細胞凋亡的影響及作用機制的研究.pdf

1、第一部分PML-C與GINS2蛋白相互作用的胞內(nèi)驗證
　　目的：通過胞內(nèi)實驗驗證PML-C與GINS2蛋白之間的相互作用。
　　方法：將誘餌蛋白質(zhì)粒pGBKT7-PMLC和文庫蛋白質(zhì)粒pACT2-GINS2共同轉(zhuǎn)化AH109酵母細胞，通過酵母雙雜交技術(shù)驗證二者在活細胞內(nèi)的相互作用；構(gòu)建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2兩種真核表達載體并共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，利用免疫共沉淀技術(shù)驗證二者之間的相互作用。<

2、br>　　結(jié)果：pGBKT7-PML-C誘餌蛋白質(zhì)粒和pACT2-GINS2靶蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH109酵母細胞后，可見藍色陽性克隆生長；pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-GINS2真核表達載體構(gòu)建成功，共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，用兔抗HA多克隆抗體沉淀與HA-PML-C相互作用的蛋白后，用鼠抗Myc單克隆抗體進行Western blotting檢測，可以檢測到Myc-GINS2蛋白。
　　結(jié)論：利用酵母雙雜交和免疫共沉淀

3、技術(shù)在胞內(nèi)驗證了PML-C與GINS2間存在相互作用。
　　第二部分PML(NLS-)與GINS2蛋白相互作用的胞內(nèi)驗證
　　目的：通過間接免疫熒光技術(shù)和免疫共沉淀實驗驗證PML(缺失核定位信號系統(tǒng)，NLS-)與GINS2蛋白之間的相互作用。
　　方法：構(gòu)建pCMV-HA-PML(NLS-)和pCMV-Myc-GINS2兩種真核表達載體并共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，利用間接免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)在胞內(nèi)驗證二者之間的相互作

4、用。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建真核表達載體pCMV-HA-PML(NLS-)及pCMV-Myc-GINS2，共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，HA-PML(NLS-)蛋白使用抗HA的一抗和FITC標記的羊抗兔IgG，Myc-GINS2蛋白使用鼠抗Myc的一抗和TRITC標記的羊抗鼠IgG，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到兩種蛋白在人胚腎293細胞內(nèi)的共定位；兔抗HA多克隆抗體沉淀與HA-PML(NLS-)相互作用的蛋白后，用鼠抗Myc單克隆抗體進行W

5、estern blotting檢測，可以檢測到Myc-GINS2蛋白。
　　結(jié)論：利用間接免疫熒光技術(shù)和免疫共沉淀實驗驗證PML(NLS-)與GINS2蛋白間存在特異性相互作用。
　　第三部分GINS2基因沉默對K562細胞和NB4細胞凋亡的影響及作用機制的研究
　　目的：通過構(gòu)建GINS2的短發(fā)卡RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染K562和NB4細胞，觀察GINS2基因沉默對K562細胞和NB4細胞凋亡的影響，為探尋白血病的診療靶

6、點及其分子作用機制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：通過構(gòu)建GINS2的短發(fā)卡RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染K562和NB4細胞，用G418篩選后，利用熒光定量PCR技術(shù)和免疫印跡檢測干擾效果；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，周期情況；間接免疫熒光檢測細胞周期蛋白的定位及免疫印跡檢測細胞周期蛋白，凋亡蛋白和信號通路蛋白的變化。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建五組GINS2的短發(fā)卡RNA干擾載體，在兩株細胞中均有干擾效果，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率明顯上升，細胞周