卡維地洛對早期糖尿病大鼠心臟的保護作用及機制研究.pdf

1、第一部分：卡維地洛對早期糖尿病大鼠過氧化應(yīng)激狀態(tài)及心臟重構(gòu)的影響及機制研究背景和目的： 糖尿病患者心臟病因死亡占死因首位約為三分之二，主要死因為心力衰竭。糖尿病心力衰竭進展快，病死率高，因其更具有隱蔽性而診斷困難，故我們認為理想的治療應(yīng)當是在早期阻斷其向心力衰竭發(fā)展的路徑。糖尿病心臟損害較早期就已經(jīng)存在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度激活、過氧化應(yīng)激、細胞外基質(zhì)增生、心肌肥厚纖維化等等，所有這些因素綜合作用促使心臟重構(gòu)及功能障礙，但是早期臨

2、床上可以無任何癥狀。卡維地洛，非選擇性的β受體阻滯劑，選擇性的α1受體阻滯劑，除了能夠阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活以外，近年來許多研究還發(fā)現(xiàn)其有抗氧化、抗增殖、抗凋亡、抗炎癥等功能，而且治療劑量時其對血糖、血脂沒有不良影響。故我們從理論上推測其可能對糖尿病較早期心肌損害產(chǎn)生有利影響。本研究旨在觀察卡維地洛是否能從抗氧化途徑及阻斷心臟重構(gòu)途徑對糖尿病大鼠早期心臟損害產(chǎn)生保護作用，并探討其機制。 方法： 1.制備糖尿病模型及卡維地

3、洛灌胃治療。SD大鼠空腹鏈脲佐菌素60mg/kg一次性腹腔注射制模，72小時后微量法隨機測血糖＞16.7mol/l入組?？ňS地洛配置成生理鹽水溶液，分別以1mg/kg，10mg/kg灌胃治療。大體動物分6組：正常對照生理鹽水灌胃組(C，n=9)；正常對照組1mg/kg/d卡維地洛灌胃組(CS，n=8)；正常對照組10mg/kg/d卡維地洛灌胃組(CL，n=9)；糖尿病生理鹽水灌胃組(D，n=9)；糖尿病1mg/kg/d卡維地洛灌胃組(D

4、S，n=9)；糖尿病10mg/kg/d卡維地洛灌胃組(DL，n=9)。 2.心臟超聲及血液動力學(xué)指標檢測。超聲指標：左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左室后壁厚度(LVPWT)、室間隔厚度(IVST)、射血分數(shù)(EF)、短軸縮短率(FS)。血液動力學(xué)指標：左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、心率(HR)、最大收縮/舒張速率。 3.心室/體重比。沿房室溝剪去心房及結(jié)締組織，計算心室

5、重/體重比值。 4.心肌組織處置及血生化指標檢測。心尖處三分之一心室肌液氮凍存，中間三分之一福爾馬林固定，心底三分之一組織勻漿采用谷胱苷肽與二硫代二硝基苯甲酸顯色反應(yīng)測定谷胱苷肽過氧化物水平，黃嘌呤—黃嘌呤氧化酶反應(yīng)檢測超氧化物歧化酶活性，過氧化氫顯色紫外分光法檢測過氧化氫酶活性，采用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物顯色檢測脂質(zhì)過氧化物標志物丙二醛水平。從頸動脈取血后，離心，分離上清液采用膽固醇氧化酶—過氧化物法檢測總膽固醇。 5.

6、病理染色及結(jié)果判斷。石蠟包埋后，分別進行HE染色、MASSON膠原染色。觀察心肌形態(tài)、膠原分布，冠脈血管內(nèi)狹窄情況，分別計算心肌組織膠原容積積分及心肌血管周圍膠原面積。 6.半定量RT-PCR檢測BCL-2、TGF-β1mRNA的表達。引物由PRIMER3設(shè)計，上海生工合成，采用一步法RT-PCR，GAPDH為內(nèi)參照。電泳后圖像分析，灰度掃描半定量各基因mRNA表達量。 結(jié)果： 1.第5周末糖尿病大鼠體重較正常對

7、照組顯著減輕(167±12vs.363±56，P＜0.01)，血糖顯著升高(20.59±2.62vs.4.94±0.48，P＜0.01)，血漿總膽固醇明顯增加(5.17±1.03vs.2.03±0.39，P＜0.01)?？ňS地洛的治療顯著增加糖尿病生理鹽水組體重，未改變血糖、血漿膽固醇水平。 2.第5周末糖尿病大鼠心室重/體重比值顯著增高，增加為正常對照的1.4倍。小劑量卡維地洛治療使糖尿病大鼠心臟重/體重比趨于正常對照水平(P

8、＞0.05)，大劑量卡維地洛進一步減小了心臟重/體重比。提示第5周末糖尿病大鼠心臟發(fā)生肥厚，卡維地洛抑制了這種改變。 3.心臟超聲顯示糖尿病組與正常對照組相比，左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率、室間隔增厚率、左室后壁增厚率等收縮功能指標均顯著降低(P＜0.05)，而左室舒張末期內(nèi)徑較正常對照組減小?？ňS地洛灌胃治療后，左室收縮末期內(nèi)徑顯著縮小，左室射血分數(shù)，左室短軸縮短率顯著提高。心室內(nèi)血流動力學(xué)顯示：糖尿病組心率顯著低于正常對照組

9、(P＜0.05)，糖尿病組左室發(fā)展壓、收縮及舒張時間變化率均顯著降低，而左室舒張末壓顯著抬高。小劑量及大劑量卡維地洛治療使糖尿病大鼠收縮及舒張時間變化率均顯著抬高，其中大劑量組還降低左室舒張末壓及糖尿病大鼠的心率。提示第5周末糖尿病大鼠心功能減低，卡維地洛改善了糖尿病大鼠心臟收縮及舒張功能。 4.卡維地洛降低正常對照組丙二醛水平。糖尿病組丙二醛、過氧化氫酶水平升高，超氧化物歧化酶、谷胱苷肽過氧化物水平顯著降低。卡維地洛治療使糖尿

10、病大鼠心肌丙二醛水平減低，增加過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽過氧化物水平，并呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。提示第5周末糖尿病心肌存在氧化—抗氧化系統(tǒng)紊亂，卡維地洛則提高了糖尿病抗氧化應(yīng)激能力。 5.HE染色及MASSON染色顯示：糖尿病心肌細胞排列紊亂，膠原纖維增生，冠脈管壁膠原纖維增厚，管腔內(nèi)未見狹窄及粥樣斑塊，心肌組織膠原容積積分及心肌血管周圍膠原面積顯著提高?？ňS地洛治療顯著降低糖尿病組心肌組織膠原容積積分及心肌血管周圍膠原面積，

11、對正常對照組無明顯影響。提示第5周末糖尿病心肌存在膠原纖維增生、心臟重構(gòu)，卡維地洛的治療抑制了心臟重構(gòu)。 6.半定量RT-PCR顯示：糖尿病組BCL-2mRNA表達顯著減低，而TGF-β1mRNA表達顯著增高。而卡維地洛的5周治療顯著增加BCL-2mRNA表達，降低TGF-β1表達，卡維地洛增加了正常對照組BCL-2mRNA表達，這種作用均呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。提示卡維地洛在基因轉(zhuǎn)錄水平抑制心臟重構(gòu)。 第二部分：卡維地洛對糖尿

12、病線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響及機制研究研究背景和目的： 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)是位于線粒體內(nèi)膜的通道復(fù)合體，在缺血后的再灌注損傷早期開放，可以誘發(fā)細胞凋亡或壞死，被學(xué)者們稱為細胞生命的主宰。超過生理濃度的鈣離子是MPTP最重要的促開放劑，近年研究發(fā)現(xiàn)，過氧化應(yīng)激能夠顯著增加MPTP對鈣離子的敏感性，促進開放，增加細胞凋亡和壞死。過氧化應(yīng)激在糖尿病

13、病理生理進程中扮演重要角色，包括改變線粒體的功能?？ňS地洛在正常心肌細胞可以通過減少過氧化應(yīng)激減輕MPT發(fā)生，然而，卡維地洛能否在糖尿病心肌細胞也產(chǎn)生類似的效果，目前國內(nèi)外尚無報道。本研究旨在觀察卡維地洛是否能減低糖尿病心肌線粒體MPTP對鈣離子的敏感性，從而產(chǎn)生線粒體保護作用。 方法： 1.制備糖尿病模型及卡維地洛灌胃治療。SD大鼠空腹鏈脲佐菌素60mg/kg一次性腹腔注射制模，72小時后微量法隨機測血糖≥16.7mo

14、l/l入組?？ňS地洛配置成生理鹽水溶液，分別以1mg/kg，10mg/kg灌胃治療。大體動物分四組：正常對照生理鹽水灌胃組(C)；糖尿病生理鹽水灌胃組(D)；糖尿病1mg/kg卡維地洛灌胃組(DS)；糖尿病10mg/kg卡維地洛灌胃組(DL)。 2.線粒體分離及分組。第5周末大鼠被斷頭處死后，開胸取心臟，制備心肌組織勻漿，密度梯度離心法分離線粒體。 線粒體吸光度測定時各組大鼠心肌線粒體再分為兩組： ①直接加入20

15、0μmol/lCa2+組； ②先加入1μmol/l環(huán)孢菌素A孵育1分鐘后，再加入200μmol/lCa2+組。 線粒體細胞色素c及活性氧檢測各組大鼠心肌線粒體再分為三組： ①直接加入200μmol/lCa2+組； ②先加入1μmol/l環(huán)孢菌素A孵育1分鐘后，再加入200μmol/lCa2+組。 ③先加入1μmol/l過氧化氫酶孵育1分鐘后，再加入200μmol/lCa2+組。 3.分光光

16、度法測定鈣離子誘導(dǎo)下線粒體發(fā)生腫脹后的吸光度變化，吸光度540nm。 4.高效液相法檢測鈣離子誘導(dǎo)下線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放后所釋放的細胞色素c濃度。 5.熒光分光光度法半定量測定鈣離子誘導(dǎo)下線粒體活性氧的產(chǎn)生。采用對活性氧敏感的2,7-二氯氫化熒光素二乙酯標記鈣離子誘導(dǎo)下產(chǎn)生的活性氧，進行半定量。熒光分光光度劑在鈣離子加入后持續(xù)測量10分鐘。發(fā)射波長475nm，接受波長525nm。 結(jié)果： 1.糖尿病大鼠

17、心肌線粒體與正常對照組相比，在鈣離子誘導(dǎo)后十分鐘時吸光度的減低更少，提示鈣離子誘導(dǎo)下線粒體發(fā)生的腫脹程度或腫脹的數(shù)量更少，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的特異性抑制劑環(huán)孢菌素A的應(yīng)用幾乎完全阻止了吸光度的減少，說明線粒體腫脹與MPTP開放有密切關(guān)系。提示糖尿病大鼠線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔對鈣離子敏感性減低?？ňS地洛治療組在鈣離子誘導(dǎo)后十分鐘時吸光度的減低與糖尿病組無顯著性差異。 2.糖尿病大鼠心肌線粒體與正常對照組相比，在鈣離子誘導(dǎo)后