錳中毒致小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙及相關(guān)分子機(jī)制.pdf

1、錳是人體必需的一種微量元素，但攝入過(guò)量則會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良作用。近年來(lái)，隨著無(wú)鉛汽油和農(nóng)藥代森錳等的廣泛使用，造成環(huán)境中錳的含量逐漸升高，增加了普通人群的接觸機(jī)會(huì)。在職業(yè)環(huán)境中，某些接觸錳的作業(yè)還可能導(dǎo)致急性中毒，因此錳對(duì)人體的影響正日益受到重視。神經(jīng)系統(tǒng)是錳的主要毒作用器官，錳神經(jīng)毒性的主要病變部位在蒼白球、丘腦下核、尾狀核、殼核以及黑質(zhì)，在臨床上表現(xiàn)為全身性的運(yùn)動(dòng)徐緩及普遍的肌肉強(qiáng)直，采用左旋多巴等治療效果也不明顯。因此在闡明錳神經(jīng)毒

2、性機(jī)制的基礎(chǔ)上提出有效的醫(yī)學(xué)防護(hù)措施具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　近年來(lái)，一些研究證明，錳導(dǎo)致腦代謝異常和DA能神經(jīng)元的損害，是導(dǎo)致震顫性麻痹癥狀的主要原因。盡管目前國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行了一系列關(guān)于錳神經(jīng)毒性機(jī)制的研究，但是其確切機(jī)制仍然不明確。
　　通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)性錳中毒小鼠的動(dòng)物模型，觀察錳中毒后動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為的變化，旨在探討錳中毒所致運(yùn)動(dòng)功能障礙的相關(guān)機(jī)制，以期為錳中毒的防治提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容包括：1.錳中毒對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)行為的影

3、響；2.錳中毒對(duì)黑質(zhì)中GABA能神經(jīng)元和DA能神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)及其活性的影響；3.錳中毒對(duì)黑質(zhì)中KCC2和NKCC1蛋白表達(dá)的影響；4.錳中毒對(duì)黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元和微管的形態(tài)學(xué)影響；錳中毒對(duì)黑質(zhì)中tau以及磷酸化tau的影響。
　　方法：
　　1.根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜選定注射點(diǎn)坐標(biāo)，采用腦立體定位法將濃度為1mol/L的MnCl2.4H2O注射進(jìn)入動(dòng)物左側(cè)尾殼核。
　　2.用滾軸實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和爬桿實(shí)驗(yàn)觀察錳中毒對(duì)小鼠

4、運(yùn)動(dòng)行為的影響。
　　3.免疫熒光雙標(biāo)法觀察錳中毒后黑質(zhì)中GFP和TH分別和Fos的共表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)黑質(zhì)中Fos、GFP、TH、KCC2和NKCC1蛋白表達(dá)水平的影響。
　　4.免疫組化觀察錳中毒對(duì)黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元的影響和免疫熒光雙標(biāo)法觀察黑質(zhì)中微管蛋白β-tubulin3和TH的共表達(dá)；Western blot檢測(cè)黑質(zhì)中β-tubulin3、tau蛋白磷酸化表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.錳中毒對(duì)

5、小鼠運(yùn)動(dòng)行為的影響：Rotarod實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示錳作用后24h，動(dòng)物從滾軸上停留時(shí)間與對(duì)照組和假手術(shù)組相比明顯減少（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明錳作用后，小鼠總水平運(yùn)動(dòng)距離(總運(yùn)動(dòng)距離)分別與正常組和假手術(shù)相比明顯縮短（P<0.01），水平運(yùn)動(dòng)能力（動(dòng)物運(yùn)動(dòng)次數(shù)）分別與正常組和假手術(shù)組無(wú)顯著變化（P>0.05）；爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示錳作用后24h，小鼠運(yùn)動(dòng)速度明顯減慢，動(dòng)物從開(kāi)始運(yùn)動(dòng)到完全轉(zhuǎn)為頭向下的時(shí)間和頭向下的時(shí)間到下

6、到桿底的時(shí)間分別與正常組和假手術(shù)相比明顯延長(zhǎng)（P<0.001），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.免疫熒光雙標(biāo)法觀察錳中毒后黑質(zhì)中DA能和GABA能神經(jīng)元形態(tài)學(xué)及其活性的變化：染錳組黑質(zhì)中Fos陽(yáng)性神經(jīng)元與對(duì)照組相比明顯增多，而DA能神經(jīng)元數(shù)量無(wú)明顯變化，且Fos和DA能神經(jīng)元并未發(fā)現(xiàn)共存；染錳后黑質(zhì)中Fos陽(yáng)性神經(jīng)元與對(duì)照組相比明顯增多，而GABA能神經(jīng)元數(shù)量無(wú)明顯變化，但Fos和GABA能神經(jīng)元大量共存；免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示染錳組

7、黑質(zhì)中Fos蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯明顯升高，但GFP和TH蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變。
　　3.KCC2抑制劑對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)行為的影響：錳染毒后黑質(zhì)中KCC2蛋白表達(dá)明顯升高，NKCC1未見(jiàn)明顯變化，使用KCC2抑制劑后KCC2蛋白表達(dá)與手術(shù)組相比有所降低，可部分逆轉(zhuǎn)錳中毒誘導(dǎo)的小鼠在滾軸上的停留時(shí)間；用KCC2抑制劑后也可部分回轉(zhuǎn)錳中毒后小鼠總水平運(yùn)動(dòng)距離的減少。
　　4.錳中毒對(duì)黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元和微管形態(tài)的影響：免疫組織

8、化學(xué)結(jié)果顯示錳中毒后黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元數(shù)量與對(duì)照組相比明顯減少，且β-tubulin3陽(yáng)性神經(jīng)元和DA能神經(jīng)元共存有一定程度的減少；Westernblot結(jié)果顯示錳中毒后β-tubulin3和tau1蛋白表達(dá)水平明顯降低，tauSer199、tauSer202明顯減少、p-tauSer396和p-tauSer404磷酸化程度明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1.錳中毒可引起小鼠運(yùn)動(dòng)行為的明顯變化，如運(yùn)動(dòng)減少、遲緩、肌肉僵直等癥狀。

9、
　　2.錳中毒使GABA能和DA能神經(jīng)元的數(shù)量未發(fā)生變化，且黑質(zhì)致密部的DA能神經(jīng)元并未被激活，而黑質(zhì)網(wǎng)狀部大量GABA能神經(jīng)元被激活，提示GABA能神經(jīng)元可能是錳中毒引起神經(jīng)損害的主要靶細(xì)胞之一。此外，還有一部分的Fos既不表達(dá)在DA能神經(jīng)元也不表達(dá)在GABA能神經(jīng)元，提示錳中毒引起的毒性效應(yīng)可能是多種遞質(zhì)綜合效應(yīng)的結(jié)果。
　　3.使用KCC2抑制劑對(duì)錳中毒引起的運(yùn)動(dòng)行為障礙有一定的改善作用,可能是由于黑質(zhì)部特有KCC2