DcR2在糖尿病腎病腎小管上皮細胞的表達與意義.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是導致終末期腎病(end stage renaldisease，ESRD)最主要的原因之一。關(guān)于DN進展機制尚未完全闡明，近年研究認為腎小管間質(zhì)損傷發(fā)揮重要作用，與DN預(yù)后直接相關(guān)。而腎小管上皮細胞衰老作為腎小管間質(zhì)損傷重要的細胞生物學事件，在DN進展中的作用受到廣泛關(guān)注和重視。
　　DN腎小管上皮細胞衰老是不依賴于增齡的衰老過程，它是在糖尿病所致的糖脂

2、代謝紊亂、持續(xù)性氧應(yīng)激以及慢性炎癥等病理性微環(huán)境下發(fā)生的應(yīng)激性早衰(stressinduced premature senescence，SIPS)。SIPS是不依賴增齡的細胞加速衰老，表現(xiàn)為細胞周期不可逆停滯和增殖能力永久性喪失，導致組織細胞再生和修復(fù)能力減退，器官功能障礙。衰老細胞除了SA-β-ga1、p16、p21等特異性分子標志外，還可釋放促炎因子、炎癥因子等衰老相關(guān)分泌表型(senescence associated secr

3、etory phenotype，SASP)損害周邊正常細胞，導致局部組織細胞炎癥與纖維化。此外，衰老細胞還具有凋亡抵抗特性可逃逸免疫細胞清除，導致衰老細胞堆積滯留，損害效應(yīng)遷延放大，進而加速疾病進展。研究表明衰老細胞凋亡抵抗的原因在于誘騙受體(decoy receptor2，DcR2)高表達。衰老成纖維細胞因高表達DcR2而逃逸細胞凋亡，可導致肝臟組織細胞纖維化與肝功能受損;前列腺癌等腫瘤細胞因DcR2表達水平上調(diào)而呈現(xiàn)凋亡抵抗，導致鄰

4、近正常細胞惡變和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。此外，在DN大鼠模型中發(fā)現(xiàn)DcR2高表達可抑制腎小管上皮細胞凋亡。而關(guān)于DN進展中DcR2表達變化是否與腎組織損傷及腎功能之間有關(guān)，以及DcR2表達變化與衰老腎小管上皮細胞之間的關(guān)系目前尚不清楚。
　　本研究首先分析DN腎小管上皮細胞DcR2、p16表達變化與腎組織損傷程度及腎功能之間的關(guān)系，然后研究DcR2表達與衰老腎小管上皮細胞之間的關(guān)系，并明確衰老腎小管細胞是否呈現(xiàn)凋亡抵抗表型。通過上述研究，以

5、期明確DcR2在DN進展中具有重要作用，并與衰老腎小管上皮細胞凋亡抵抗密切相關(guān)。以為DN早期干預(yù)衰老腎小管細胞尋找關(guān)鍵靶分子，并從靶向清除衰老細胞角度提高DN救治水平和改善腎臟預(yù)后奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.臨床資料:選取2010-2013年在第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院腎內(nèi)科住院的2型糖尿病患者36例，并經(jīng)腎活檢病理檢查診斷為DN。根據(jù)腎小管間質(zhì)損傷程度分為早期DN和進展期DN，各18例。對照組腎組織標本為在我院住院的腎錯

6、構(gòu)瘤或腎臟腫瘤切除術(shù)病灶旁組織經(jīng)病理檢查為正常的組織。采集各組患者的臨床資料及相關(guān)實驗室檢查結(jié)果，根據(jù)CKD-EPI公式計算腎小球濾過率(estimated glomerularfiltration，eGFR)。
　　2.腎組織損傷程度評分與分級標準:根據(jù)2010年《美國腎臟病雜志》發(fā)表的新型病理分級系統(tǒng)診斷標準進行評分。按照腎小管萎縮和代償性擴張、腎間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎癥程度將DN分為早期DN(early DN)和進展期DN（pr

7、ogressive DN）。
　　3.檢測指標與方法
　　3.1免疫組化檢測DcR2、p16表達;
　　3.2免疫熒光檢測DcR2、p16、FLIP、caspase-3表達;
　　3.3利用激光共聚焦觀察DcR2與p16、FLIP、caspase-3之間共表達情況。
　　4.結(jié)果判讀方法
　　結(jié)果的判讀采用雙盲法，由兩名與本研究無關(guān)人員判讀。每張載玻片連續(xù)計數(shù)10個高倍視野下相關(guān)指標陽性表達的腎小管上

8、皮細胞（胞核表達）或是腎小管（胞漿表達），并計算陽性表達的腎小管上皮細胞或腎小管占腎小管細胞總數(shù)的百分比。共聚焦顯微鏡下計數(shù)DcR2與p16、DcR2與FLIP、DcR2與caspase-3雙陽性腎小管數(shù)及各指標單陽性腎小管數(shù)占腎小管總數(shù)百分比。
　　5.統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以(x)±s表示。DN患者的臨床資料及p16、DcR2陽性表達百分率與對照組比較，正態(tài)分布資料采用t檢驗，非正態(tài)分

9、布資料比較采用秩和檢驗。腎組織P16、DcR2陽性表達百分率與臨床資料采用Pearson相關(guān)分析，與腎組織病理損傷程度評分采用Spearman相關(guān)分析。p＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.36例DN患者臨床資料特征
　　36例DN患者中男性17例，女性19例。與對照組相比，DN組患者收縮壓、尿蛋白定量、尿NAG、尿蛋白/肌酐、糖化血紅蛋白、血肌酐、光抑素C、尿素氮、甘油三酯顯著增高，eGFR顯著降低(P

10、＜0.05)。DN組同對照組年齡、性別、BMI、舒張壓、尿酸、C反應(yīng)蛋白、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.DN腎組織DcR2、p16表達與臨床資料及腎組織損傷評分的相關(guān)性
　　DN中DcR2只表達于腎小管上皮細胞，p16可表達于腎小球細胞、腎小管上皮細胞與腎間質(zhì)細胞。正常對照組腎組織p16、DcR2表達水平低下。腎小管上皮細胞DcR2、p16陽性表達百分率同對照組相比顯著增

11、高，且進展期DN腎小管細胞上皮DcR2、p16表達水平較早期DN明顯增加。
　　DN患者腎組織腎小管上皮細胞DcR2、p16表達量與收縮壓、尿蛋白定量、尿NAG、尿蛋白/肌酐、甘油三脂、尿素氮、血肌酐、光抑素C呈正相關(guān)，與eGFR呈負相關(guān)，而與年齡、舒張壓、BMI、白蛋白、糖化血紅蛋白、膽固醇、尿酸、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、C反應(yīng)蛋白無相關(guān)性。
　　DN患者腎組織腎小管上皮細胞DcR2、p16表達量與腎組織系膜增生、腎小

12、球硬化、腎間質(zhì)炎癥、腎小管萎縮與間質(zhì)纖維化病變程度顯著相關(guān)。
　　3.DN腎組織DcR2與p16的共表達情況
　　激光共聚焦示DN腎組織中DcR2與p16共表達于同一腎小管細胞，共表達率隨著腎小管間質(zhì)損傷的評分升高而增加，且DcR2表達量較p16少。可見小部分p16與DcR2單陽性腎小管細胞，且p16單陽性腎小管細胞百分率較DcR2單陽性腎小管細胞百分率高，DN各組p16單陽性腎小管細胞百分率較對照明顯增高，DcR2單陽性腎

13、小管細胞在各個組間比較無顯著差異。
　　4.DN腎組織DcR2與凋亡相關(guān)標志的共表達情況
　　激光共聚焦示DcR2與抗凋亡分子FLIP共表達于同一腎小管細胞，共表達率隨著腎小管間質(zhì)損傷的評分升高而增加?？梢娦〔糠諪LIP單陽性腎小管細胞，其百分率較DcR2單陽性腎小管百分率高，F(xiàn)LIP單陽性腎小管細胞百分率在各組間比較無顯著差異。免疫共染示DcR2陽性的腎小管細胞不表達或低表達caspase-3。早期DN中caspase-3