SARA在糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用與分子機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是終末期腎臟疾病(Endstage renal disease，ESRD)最常見的原因之一。腎小管間質(zhì)纖維化(Tubulointerstitial fibrosis，TIF)是糖尿病腎病發(fā)展到ESRD的最主要病理改變。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial to mesenchymaltransition，EMT)是腎間質(zhì)纖維化的早期且可逆階段，細(xì)

2、胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)沉積是腎間質(zhì)纖維化的主要組織學(xué)改變。研究表明高糖可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞EMT及ECM沉積，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor, TGF-β1)在這一過程中起關(guān)鍵作用。TGF-β1/Smads信號(hào)通路是TGF-β1誘導(dǎo)EMT及ECM沉積的主要途徑，受多個(gè)因素的調(diào)控。
　　 Smad錨著蛋白(Smad anchor for recept

3、or activation，SARA)是TGF-β/Smad信號(hào)通路的銜接蛋白(Adaptor protein)。SARA可呈遞Smad2和Smad3至活化的TGF-βⅠ型受體(Tβ I R)，促進(jìn)其磷酸化，介導(dǎo)TGF-β1信號(hào)由其受體活化到核轉(zhuǎn)位的過程。SARA是Smad2磷酸化及核轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵因子，而Smad3的活化不依賴于SARA。研究顯示SARA與EMT及纖維化呈負(fù)相關(guān)，靶向SARA的干預(yù)策略能夠逆轉(zhuǎn)EMT。基于以上分析，我們認(rèn)為

4、SARA可能與糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞EMT及ECM沉積有關(guān)，為此，本實(shí)驗(yàn)開展如下的研究。
　　 目的：觀察糖尿病腎病患者腎組織中SAA的表達(dá)，初步探討SARA與糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。
　　 方法：隨機(jī)選取經(jīng)臨床和腎臟病理確診為糖尿病腎病及微小病變患者(原發(fā)性腎病)各6人。采用HE、Masson、PASM染色觀察腎臟普通病理改變并評(píng)價(jià)腎間質(zhì)損傷和膠原沉積程度；免疫組化檢測(cè)腎臟組織SARA表達(dá)變化。
　　

5、結(jié)果：腎臟普通病理結(jié)果顯示糖尿病腎病患者腎小球系膜基質(zhì)中重度增生，結(jié)節(jié)狀硬化，基底膜彌漫性或節(jié)段性增厚僵硬，腎小管萎縮并代償性擴(kuò)張，腎間質(zhì)可見多灶性纖維化；對(duì)照組患者可見系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕度增生，基底膜不厚，輕度的腎小管上皮細(xì)胞顆粒樣變性及空泡變性，腎間質(zhì)和腎血管未見明顯異常。糖尿病腎病患者腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)及膠原沉積面積明顯高于對(duì)照組。免疫組化顯示：對(duì)照組患者腎小管上皮細(xì)胞有明顯的SARA表達(dá)，在腎小球系膜細(xì)胞也有一定量的表達(dá)；而糖尿病

6、腎病患者SARA表達(dá)明顯下調(diào)，尤其在腎小管上皮細(xì)胞萎縮及發(fā)生腎間質(zhì)纖維化的區(qū)域。
　　 結(jié)論：糖尿病腎病患者腎組織(特別是腎小管)SARA表達(dá)下降；SARA表達(dá)下降的同時(shí)伴有腎小管間質(zhì)損傷和膠原沉積，提示SARA可能與糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化有關(guān)。
　　 目的：闡明SARA在高葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT及ECM沉積中的作用，探討以SARA為靶點(diǎn)抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT及ECM沉積的策略。
　　 方法

7、：用高葡萄糖(30mM D-葡萄糖)刺激HK-2細(xì)胞，通過細(xì)胞免疫熒光、Western blot及Realtime PCR檢測(cè)波形蛋白(Vimentin)、緊密連接蛋白(Zona occludens-1，ZO-1)及SARA的表達(dá)，通過Western blot及Realtime PCR檢測(cè)纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)和Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)的表達(dá)；轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)SARA質(zhì)粒(SARA(WT))及敲除SBD結(jié)構(gòu)

8、域的SARA質(zhì)粒(SARA(dSBD))，再予高糖刺激，檢測(cè)HK-2細(xì)胞Vimentin、ZO-1、FN、ColⅠ的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：30mM D-葡萄糖刺激后，HK-2細(xì)胞ZO-1蛋白及其mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性降低，Vimentin、FN和ColⅠ蛋白及其mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性升高，而SARA蛋白及其mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性下降。與高糖刺激組相比，過表達(dá)SARA使HK-2細(xì)胞ZO-1表達(dá)上調(diào)，Vimentin、FN和

9、ColⅠ表達(dá)下調(diào)；但轉(zhuǎn)染SARA dSBD質(zhì)粒對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ZO-1、Vimentin、FN和ColⅠ表達(dá)無明顯影響。
　　 結(jié)論：高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及ECM沉積；高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞SARA表達(dá)下調(diào)；過表達(dá)SARA可逆轉(zhuǎn)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，抑制ECM生成，這一效應(yīng)依賴于SARA的SBD結(jié)構(gòu)域。
　　 目的：闡明SARA調(diào)控高葡萄糖誘導(dǎo)的。腎小管上皮細(xì)胞EMT及ECM沉積的分子機(jī)制。
　　 方法

10、：用高葡萄糖(30mM D-葡萄糖)刺激HK-2細(xì)胞，Westernblot及Realtime PCR檢測(cè)TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)，Western blot檢測(cè)p-Smad2、p-Smad3的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)SARA質(zhì)粒及SARA(dSBD)質(zhì)粒，再予高糖刺激，檢測(cè)Smad2、Smad3、p-Smad2、P-Smad3的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：高糖可誘導(dǎo)TGF-β1、Smad3蛋白及其mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性上

11、調(diào)；Smad2 mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)，而其蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性下調(diào)；高糖可促進(jìn)Smad2和Smad3磷酸化，但Smad3的活化時(shí)間更長(zhǎng)。過表達(dá)SARA可上調(diào)Smad2的蛋白表達(dá)，但對(duì)其mRNA表達(dá)水平無明顯影響，過表達(dá)SARA對(duì)Smad3的蛋白及其mRNA表達(dá)無明顯影響；轉(zhuǎn)染SARA(dSBD)質(zhì)粒對(duì)Smad2、Smad3的表達(dá)無明顯影響。過表達(dá)SARA可延長(zhǎng)Smad2活化時(shí)間，而Smad3的活化時(shí)間相對(duì)縮短，從而改變Smad2