Rap1b對糖尿病腎病腎小管上皮細胞氧化損傷及凋亡的影響與機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病最常見并發(fā)癥，也是引起糖尿病病人死亡的最主要原因。近年來，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，從而致使慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease，CKD)的發(fā)病率和患病率不斷攀升，已成為糖尿病患者的主要死亡原因之一。大量臨床研究表明，未控制的高血糖是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，但

2、其作用機制仍不清楚。因此，明確糖尿病腎病的發(fā)病機制，預(yù)防或延緩其發(fā)生及發(fā)展有著重要的科學(xué)和社會意義，符合我國國情，并有一定的迫切性。
　　 大量研究證實腎小管損傷在糖尿病腎損傷中具有重要的意義，在糖尿病腎病的早期即可觀察到腎小管細胞的氧化損傷和凋亡。腎小管上皮細胞的凋亡可導(dǎo)致腎小管再吸收和分泌功能異常，促進腎小管上皮細胞的萎縮和間質(zhì)纖維化，是糖尿病腎病進展為腎衰竭的主要因素。因此，人們開始重視腎小管上皮細胞氧化損傷和凋亡在糖尿病

3、腎病發(fā)病機制中的作用。
　　 有研究表明，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在高血糖誘導(dǎo)的小管細胞損傷中起重要作用。高血糖造成腎臟小管上皮細胞ROS生成增加，ROS可活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)效應(yīng)(如PKC、MAPK、JAK/STAT等)，又可作為胞內(nèi)信號激活某些轉(zhuǎn)錄因子(如NFκB、內(nèi)皮素-1等)，導(dǎo)致 TGF-β1等表達增加。上述信號分子進一步誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，不斷放大高糖造成的細胞損傷，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(

4、extracellularmatrix，ECM)合成增加、基底膜增厚、系膜擴張，最終導(dǎo)致進行性的腎小球硬化和腎小管萎縮，引起腎功能下降和衰竭。糖尿病過度產(chǎn)生ROS是糖尿病合并癥時細胞損傷的首要和原始啟動因子。因此，研究高葡萄糖誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的調(diào)控機制是國際腎臟研究領(lǐng)域的熱點。
　　 Rap1(Ras相關(guān)蛋白1)是原癌基因Ras超家族成員之一。Rap1具有廣泛的細胞生物學(xué)功能，包括細胞生長、分化、肥大、增殖，參與EMT的形成，介導(dǎo)

5、腎小管離子的轉(zhuǎn)運和吸收。已知Ras GTP酶與細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生有關(guān)；Ha-Ras-Val12突變可誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生；C-Raf，一個Rap1b下游蛋白，通過控制線粒體ROS的產(chǎn)生和Ca2+平衡，調(diào)節(jié)細胞的凋亡[54]；Ras/cAMP信號通路調(diào)節(jié)線粒體膜電位和線粒體ROS的產(chǎn)生，而ROS對Ras/cAMP信號又有反饋調(diào)節(jié)作用；特別是發(fā)現(xiàn)Epac1，一個Rap1的激活蛋白可轉(zhuǎn)移至線粒體并表達在線粒體基質(zhì)，而Rap1及其下游蛋白Raf

6、也被發(fā)現(xiàn)在細胞線粒體，說明Rap1在線粒體ROS產(chǎn)生過程中可能起重要的調(diào)節(jié)作用。本實驗室既往研究顯示，原癌基因Ras超家族成員之一的Rap1b，可以通過逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細胞中高糖引起的線粒體ROS的生成增加以及細胞色素C的釋放，抑制細胞凋亡。在之前的動物模型研究中我們發(fā)現(xiàn)大鼠腎組織表達Rap1b，在糖尿病狀態(tài)下大鼠腎臟表達ROS明顯升高，同時伴有腎小管Rap1b的表達顯著增高。但具體機制尚不明確。本研究旨在初步探討糖尿病腎病患者腎臟Rap

7、1b的表達情況，為進一步研究其在糖尿病腎病發(fā)病過程中的作用提供實驗依據(jù)?；谝陨戏治?，我們認為Rap1b可能與糖尿病腎病小管上皮細胞線粒體氧化損傷及細胞凋亡的產(chǎn)生有關(guān)，為此，本實驗開展如下的研究。
　　 第一章、Rap1b在糖尿病腎病患者腎組織中的表達及其與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系
　　 目的：觀察糖尿病腎病患者腎組織中Rap1b的表達，初步探討Rap1b與糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。
　　 方法：隨機選取經(jīng)臨床和腎

8、臟病理確診為糖尿病腎病及微小病變患者(原發(fā)性腎病)各6人。采用Masson、PASM、PAS染色觀察腎臟普通病理改變；免疫組化檢測腎臟組織Rap1b表達變化。
　　 結(jié)果：腎臟普通病理結(jié)果顯示腎活檢組織呈典型的糖尿病結(jié)節(jié)性硬化樣改變：腎小球系膜基質(zhì)中-重度增生，多個節(jié)段呈結(jié)節(jié)狀硬化，基底膜彌漫性或節(jié)段性增厚僵硬，部分節(jié)段毛細血管袢擴張，多灶性腎小管萎縮并伴部分小管代償性擴張，腎間質(zhì)多灶性纖維化；對照組患者可見系膜細胞及基質(zhì)僅節(jié)段

9、性輕度增生，基底膜不厚，個別腎小管上皮細胞顆粒樣變性，腎間質(zhì)和腎血管未見明顯異常。糖尿病腎病患者腎小管間質(zhì)損傷程度明顯高于對照組。免疫組化顯示：對照組患者腎小管上皮細胞有明顯的Rap1b表達；而糖尿病腎病患者Rap1b表達上調(diào)，尤其在腎小管上皮細胞萎縮及發(fā)生腎間質(zhì)纖維化的區(qū)域。
　　 結(jié)論：糖尿病腎病患者腎組織，特別是腎小管，Rap1b表達上調(diào)；Rap1b表達上調(diào)的同時伴有腎小管間質(zhì)損傷，提示Rap1b可能與糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維

10、化有關(guān)。
　　 第二章：Rap1b通過線粒體途徑調(diào)控高葡萄糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞氧化損傷和凋亡
　　 目的：探討高葡萄糖對腎小管上皮細胞線粒體氧化應(yīng)激的損傷機制，以及腎小管上皮細胞Rap1b蛋白對高糖誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷的保護作用。
　　 方法：用不同濃度D-葡萄糖(5.5mM，10mM，20mM，30mM)處理正常人近端腎小管上皮細胞株(D-甘露醇作為等滲對照組)，在不同時間點提取細胞mRNA和蛋白，通過細胞免

11、疫熒光以及Westemblot檢測高糖對Rap1b蛋白的影響。通過Mito SOX熒光染色、線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性檢測、線粒體ATP檢測、線粒體抗氧化酶活性檢測及Real-time PCR，評價高糖對線粒體相關(guān)功能的抑制作用。通過細胞免疫熒光以及 Western blot檢測高糖對小管上皮細胞的caspase-9、caspase-3的表達以及細胞凋亡的影響。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cDNA3.1/Rap1b質(zhì)粒及兩個失活性的Rap1b真核表達質(zhì)粒(Ra

12、p1bS17N，第17位絲氨酸突變?yōu)樘扉T冬氨酸；Rap1bT61R，第61位蘇氨酸突變?yōu)榫彼?使HK2細胞過表達Rap1b，觀察Rap1b對高糖誘導(dǎo)的上述指標的變化。
　　 結(jié)果：HK-2細胞中高糖導(dǎo)致Rap1b蛋白表達明顯下降，尤其是Rap1bGTP呈濃度及時間依賴模式；等滲對照組Rap1b表達與正常對照組比較無顯著性差異。
　　 HK-2細胞經(jīng)30mM葡萄糖處理后，高糖誘導(dǎo)線粒體呼吸鏈活性受抑，ATP生成減少，抗氧

13、化酶GSH Px及CAT的活性受抑，MnSOD2的mRNA水平表達升高，線粒體ROS的生成增加，procaspase-9、procaspase-3的表達下降，細胞發(fā)生細胞凋亡。而過表達Rap1b蛋白表達，可以逆轉(zhuǎn)上述高糖誘導(dǎo)的線粒體的氧化應(yīng)激損傷以及細胞凋亡。
　　 結(jié)論：Rap1b可以特異性逆轉(zhuǎn)高葡萄糖誘導(dǎo)的線粒體呼吸鏈活性受抑、ATP生成減少以及抗氧化酶的活性受抑，進而抑制線粒體ROS的生成增加，促進清除，保護細胞，減輕氧化

14、應(yīng)激引起的細胞凋亡的發(fā)生。
　　 第三章、Rap1b通過調(diào)節(jié)線粒體動力蛋白及線粒體生源基因表達介導(dǎo)高葡萄糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞氧化損傷和凋亡的調(diào)控
　　 目的：探討Rap1b蛋白對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞氧化損傷及凋亡的作用機制。
　　 方法：常規(guī)培養(yǎng)正常人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)，cDNA3.1/Rap1b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細胞，建立穩(wěn)定表達的細胞株。采用realtime-PCR及Westem blot檢

15、測線粒體融合分裂蛋白Drp-1、Mfn2以及線粒體生源基因PGC-1α、NRF-1的mRNA水平及蛋白水平的表達。
　　 結(jié)果：過表達的Rap1b可以特異性的明顯下調(diào)高糖誘導(dǎo)的Drp-1的mRNA及蛋白的表達水平的升高，上調(diào)Mfn2的表達水平，逆轉(zhuǎn)上述高糖誘導(dǎo)的線粒體融合分裂的失衡狀態(tài)，加強線粒體融合與分裂過程的協(xié)調(diào)性。不僅如此，過表達的Rap1b還可以特異性上調(diào)由于高糖誘導(dǎo)的線粒體生源基因PGC-1α、NRF-1的表達下降。<