利用基因工程制備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽NP14的研究.pdf

1、ProsaptideTX14是一種新型的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽，由鞘脂激活蛋白原具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的序列改造而成，鞘脂激活蛋白原或ProsaptideTX14可以與神經(jīng)細(xì)胞膜上的PT敏感的G受體結(jié)合，活化細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)，刺激神經(jīng)細(xì)胞中乙酰膽堿酯酶的活性，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。 由于鞘脂激活蛋白原為新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，除了其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性之外，在外圍組織的廣泛分布，提示ProsaptideTX14可能還有其它生物活性。因此，進(jìn)一

2、步深入探討ProsaptideTX14的生物活性及其可能的分子機(jī)制，將為研究開發(fā)其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值奠定基礎(chǔ)?；蚬こ碳夹g(shù)是制備短肽的一種行之有效的方法，我們將利用Prosaptide的氨基酸序列合成目的基因，以串聯(lián)連接方式得到多拷貝的目的片段，采用原核表達(dá)的方法高效的制備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽NP14，進(jìn)而研究其生物活性。實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容為： [目的] 采用基因工程的方法制備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽NP14。 [方法] 1

3、.NP14基因來(lái)源于ProsaptideTX14的14個(gè)氨基酸，它的第一個(gè)氨基酸由蘇氨酸改為絲氨酸，然后，通過(guò)PCR串聯(lián)成雙拷貝基因2NP，在小肽NP14兩端各引進(jìn)一個(gè)蛋氨酸，從而建立了蛋白裂解位點(diǎn)。 2.通過(guò)堿性磷酸酶的脫磷酸反應(yīng)處理的載體pUC18與雙拷貝基因2NP片段做平端連接，構(gòu)建了克隆載體pUC18-2NP。 3.通過(guò)藍(lán)白斑篩選得到的重組陽(yáng)性克隆pUC18-2NP在大腸桿菌JM109中增殖后，經(jīng)質(zhì)粒的提取，

4、EcoT14I的酶切，鑒定出陽(yáng)性重組子。經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)2NP片段確已插入載體。 4.經(jīng)EcoT14I酶切pUC18-2NP產(chǎn)生出大量帶有粘性末端的2NP片段，通過(guò)自身連接獲得多拷貝串聯(lián)體。 5.多拷貝基因被構(gòu)建到來(lái)源于質(zhì)粒pET32a(+)的質(zhì)粒pETEcoT中，在pET32a(+)的多克隆位點(diǎn)引進(jìn)限制性內(nèi)切酶EcoT14I識(shí)別序列CCAAGG，利用其酶切后可產(chǎn)生非鏡相對(duì)稱粘性末端，一次連接反應(yīng)就構(gòu)建出一系列不同基因

5、拷貝數(shù)的表達(dá)載體。這樣表達(dá)出的融合蛋白即可被溴化氫剪切出不殘留任何外源氨基酸的單肽。 6.采用多種篩選方法鑒定多拷貝陽(yáng)性克隆，最終通過(guò)PCR-array法篩選到多拷貝陽(yáng)性克隆。 7.多拷貝基因與硫氧還原蛋白TrxA融合表達(dá)。不同拷貝數(shù)的小肽融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中均獲得高效表達(dá)。 [結(jié)果] 我們根據(jù)ProsaptideTX14合成了雙拷貝基因2NP，通過(guò)平端連接構(gòu)建了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽NP1