24612.胰島素陽性及陰性細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)的構(gòu)建

1、汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文題目：目：胰島素陽性及陰性細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)的構(gòu)建胰島素陽性及陰性細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)的構(gòu)建英文題目：英文題目：Generationofaduallabelingsystemfinsulinpositivenegativecells姓名：范文竹學(xué)號：10808066學(xué)院：理學(xué)院導(dǎo)師：魏熾炬教授專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)入學(xué)日期：2008年9月答辯日期：2011年5月汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文I摘要細(xì)胞標(biāo)記與追蹤是研究胰腺發(fā)育與再生的

2、一種重要手段。傳統(tǒng)的CreloxP細(xì)胞標(biāo)記系統(tǒng)需要兩個質(zhì)粒，其中一個用于組織特異性表達(dá)重組酶Cre，另一個用于組成型表達(dá)報(bào)告基因，但該系統(tǒng)目前只能用于單一種類細(xì)胞的標(biāo)記。為進(jìn)一步改善細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對胰島素陽性、陰性細(xì)胞的雙標(biāo)記，本研究設(shè)計(jì)了一種新的單載體系統(tǒng)，該載體利用大鼠胰島素啟動子（RIP）控制重組酶Cre的表達(dá)，利用組成型CMV強(qiáng)啟動子控制另一個重組酶Flp、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）、紅色熒光蛋白基因（DsRed）、及綠

3、色熒光蛋白基因（EGFP）的表達(dá)。同時，在重組酶Cre及Flp的編碼區(qū)內(nèi)部各插入一個內(nèi)含子，以消除質(zhì)粒制備過程中外源基因的非特異性表達(dá)，從而使胰島素陽性、陰性細(xì)胞分別被標(biāo)記為綠色和紅色。在該載體的構(gòu)建過程中我們發(fā)現(xiàn)，由于Cre酶的放大作用，RIP的組織特異性顯著降低。為提高RIP的組織特異性，本研究探討了加快Cre在細(xì)胞內(nèi)的分解速度，降低Cre在細(xì)胞中的表達(dá)量，或減弱Cre的酶活性等途徑。研究結(jié)果表明，Cre基因173位精氨酸突變?yōu)榻M氨