蘋果鐵高效基因型生物技術(shù)的研究——MxNramp1和MxIrt1基因的克隆.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)以中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物研究所篩選到的一個(gè)蘋果鐵高效基因型——小金海棠(Malus xiaojinensisCheng et Jiang)為試材,分別克隆了小金海棠的抗缺鐵相關(guān)基因MxNramp1基因的752bp基因組DNA片段和Fe(Ⅱ)-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(MxIrt1)的cDNA全長(zhǎng),為深入探討小金海棠抗缺鐵的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ).(1)以異源的小麥Nramp基因片段和玉米Fe(Ⅱ)-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ZmIrt)片段為探針進(jìn)行了雜交分析

2、.Southern雜交結(jié)果表明:小金海棠基因組中存在該兩家族基因.Northern雜交結(jié)果表明:在根中和葉中,Nramp基因均能得以轉(zhuǎn)錄且受缺鐵脅迫的誘導(dǎo)而加強(qiáng).Fe(Ⅱ)-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在根中的轉(zhuǎn)錄也受到缺鐵脅迫的誘導(dǎo),并隨缺鐵脅迫處理天數(shù)的增加而加強(qiáng).(2)根據(jù)植物Nramp基因家族的功能保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,通過常規(guī)PCR法從小金海棠基因組DNA中擴(kuò)增出了MxNramp1基因的752bp的特異性產(chǎn)物;序列分析表明,該片段所推導(dǎo)的氨基酸

3、序列與小麥Nramp基因片段(雜交用的探針片段)及水稻OsNramp3基因分別具有98％和83％的同源性.該片段的克隆為進(jìn)一步克隆MxNramp1基因的全長(zhǎng)提供了條件.(3)根據(jù)植物Irt基因家族的功能保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,首先通過常規(guī)PCR法從缺鐵脅迫處理的小金海棠根系cDNA文庫中克隆了Fe(Ⅱ)-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MxIrt1的490bp的片段,然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物,通過RACE法從該cDNA文庫中克隆了MxIrt1基因的cDNA全長(zhǎng)

4、.序列分析表明,該基因的cDNA全長(zhǎng)為1398bp,開放閱讀框?yàn)?095bp,編碼一個(gè)364個(gè)氨基酸的多肽,與番茄和豌豆中的該家族基因分別具有71％和69％的氨基酸同源性,是一種膜蛋白,具有1個(gè)信號(hào)肽序列,7個(gè)跨膜螺旋,3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)0-糖基化位點(diǎn),分子量大約為39.174kD,等電點(diǎn)為8.07.(4)成功地構(gòu)建了小金海棠Fe(Ⅱ)-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MxIrt1的酵母表達(dá)載體pDB<'leu>-MxIrt1,并正在進(jìn)行該基因的確切