植物縮合單寧對(duì)大腸桿菌的抑制作用及抑菌機(jī)理的研究.pdf

1、近些年，隨著食源性致病菌大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）O157:H7在世界范圍內(nèi)的爆發(fā)流行，嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康，已成為世界重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。牛是E. coli O157:H7主要的攜帶者，不表現(xiàn)任何臨床癥狀，但排出的糞便對(duì)周?chē)h(huán)境會(huì)有污染，常會(huì)造成此病爆發(fā)流行。針對(duì)E. coli O157:H7，到目前為止沒(méi)有有效的防治措施，減少牛體內(nèi)E. coli的排出被認(rèn)為是最有效的策略。紫色達(dá)利菊牧草分布廣、適

2、口性好、單寧含量高，且對(duì)E. coli O157:H7有較好的抑制作用。因此，本文主要通過(guò)草場(chǎng)放牧試驗(yàn)和體外試驗(yàn)來(lái)分析紫色達(dá)利菊牧草對(duì)大腸桿菌的抑制作用；又通過(guò)定性和定量試驗(yàn)來(lái)分析非致病性和致病性大腸桿菌對(duì)紫色達(dá)利菊牧草和紅豆草牧草所含濃縮單寧的敏感性；再選取非致病性大腸桿菌作為模型，從單寧對(duì)大腸桿菌細(xì)菌結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞外膜、細(xì)胞內(nèi)膜、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體以及脂肪酸結(jié)構(gòu)組成的影響，通過(guò)紫色達(dá)利菊牧草和紅豆草牧草分析縮合單寧抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的機(jī)理

3、，從而為提出一種合理降低大腸桿菌排出策略奠定理論基礎(chǔ)。具體結(jié)論如下：
　　1.紫色達(dá)利菊牧草對(duì)牛糞便中大腸桿菌菌群的數(shù)量有明顯降低的作用，且秋季放牧更明顯。體外模擬瘤胃和大腸試驗(yàn)，結(jié)果也表明紫色達(dá)利菊縮合單寧對(duì)牛瘤胃和大腸內(nèi)E. coli均有抑制作用，且對(duì)瘤胃內(nèi)的作用較強(qiáng)。
　　2.通過(guò)藥物敏感性的定性試驗(yàn)分析表明：2株非致病性菌株 ATCC25922和ATCC35352和5株致病性 O157:H7菌株3081、 H4420

4、N、 E318N、 EDL933和R508N2006對(duì)同一來(lái)源單寧的敏感性相同；紫色達(dá)利菊單寧在濃度0.01～0.05mg/mL，紅豆草單寧在濃度0.05～2mg/mL對(duì)E. coli都有抑制作用；且同一濃度下，紫色達(dá)利菊所含縮合單寧有著較強(qiáng)的抑菌作用。定量試驗(yàn)即最小抑菌濃度（MIC）結(jié)果表明：紫色達(dá)利菊單寧的MIC為20μg/mL，而紅豆草單寧的MIC為100μg/mL；且兩種單寧對(duì)致病性和非致病性大腸桿菌的敏感程度相同。
　　

5、3．在單寧抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)理研究時(shí)選擇了1株非致病性菌株ATCC25922作為模型，通過(guò)紫色達(dá)利菊單寧和紅豆草單寧對(duì)E. coli外膜、內(nèi)膜、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體和脂肪酸變化等方面進(jìn)行分析。提出了單寧對(duì)大腸桿菌的抑制機(jī)理。
　　單寧使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。單寧使大腸桿菌細(xì)胞發(fā)生聚集，且隨著單寧濃度的增加，聚集作用增強(qiáng)；單寧增加了大腸桿菌的細(xì)胞外膜通透性，使細(xì)菌細(xì)胞外膜的完整性受到破壞；單寧增加了大腸桿菌內(nèi)膜的通透性，而且受溫度和 pH變化

6、的影響。
　　單寧也使細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成成分發(fā)生了變化。縮合單寧對(duì)蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的沉淀能力(P<0.001)，尤其對(duì)Rubisco蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)更為明顯。以蛋黃卵磷脂作為模型，結(jié)果顯示單寧對(duì)脂質(zhì)體都有不同程度的凝聚作用，而且隨著單寧濃度的增大，凝聚作用增強(qiáng)；通過(guò)LIVE/DEAD? BacLight細(xì)菌活力試劑盒和熒光顯微鏡也觀察到了這個(gè)現(xiàn)象。單寧可使脂肪酸構(gòu)成發(fā)生變化，低濃度紫色達(dá)利菊單寧，使得成對(duì)脂肪酸 C16：0/C16：1、T

7、T16：0/TT16：1、C18：0/C18：1、SFA/USFA顯著升高（P＜0.01），而低濃度紅豆草單寧無(wú)影響；高濃度時(shí)紫色達(dá)利菊單寧對(duì)脂肪酸變化沒(méi)有影響，而紅豆草單寧增加了主要脂肪酸含量。
　　單寧會(huì)發(fā)生自氧化作用，產(chǎn)生H2O2，進(jìn)而使細(xì)菌細(xì)胞受到影響。
　　綜合考慮，推測(cè)單寧抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)理是單寧通過(guò)結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，聚集細(xì)胞脂質(zhì)，以及單寧自氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫，而干擾細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)一步改變細(xì)菌細(xì)胞壁脂肪