家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3及相互作用蛋白研究.pdf

1、絲氨酸蛋白酶抑制劑超基因家族,參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)多種生理反應(yīng)。為深入研究絲氨酸蛋白酶抑制劑及互作因子在家蠶免疫防御中的作用機(jī)制,本文以家蠶為材料,做了如下研究:以脂肪體cDNA為模板克隆了家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin-3)基因。利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了Bmserpin-3的編碼區(qū),并純化了表達(dá)產(chǎn)物,利用純化的蛋白,研究了Bmserpin-3參與家蠶黑化作用的機(jī)理;采用His-pull down技術(shù)篩選了與家蠶 serpin-3相互作

2、用蛋白;用RNAi結(jié)合熒光定量 PCR的方法研究了Bmserpin-3對(duì)靶標(biāo)蛋白的調(diào)控。主要研究結(jié)果如下：
　?、偶倚Q絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3基因的克??；本實(shí)驗(yàn)以家蠶幼蟲脂肪體cDNA為模板,擴(kuò)增獲得了家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3的基因序列(GenBank登錄號(hào)NP_001040318.1)。克隆的家蠶serpin-3基因開放閱讀框含1311 bp,編碼458個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量約為49.33 kD,等電

3、點(diǎn)約為5.28,信號(hào)肽是前22個(gè)氨基酸殘基,395-416是預(yù)測(cè)的活性位點(diǎn),410位的Lys是預(yù)測(cè)的P1位點(diǎn)。
　?、萍倚Q絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3基因的原核表達(dá)；將Bmserpin-3的編碼區(qū)克隆到表達(dá)載體pET-28a(+),轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析表明,轉(zhuǎn)化了serpin-3重組載體的BL21菌,在約49 kD位置出現(xiàn)了特異性條帶,而對(duì)

4、照組BL21菌、空pET-28a(+)轉(zhuǎn)化的BL21菌、非誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化去信號(hào)肽的pET-28a-Bmserpin-3重組菌與誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化去信號(hào)肽的pET-28a-Bmserpin-3重組菌在同一位置則沒有出現(xiàn)此特異條帶,說明Bmserpin-3在大腸桿菌中得到表達(dá),并對(duì)其進(jìn)行了純化。
　　⑶家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3參與黑化作用。家蠶serpin-3與果蠅、煙草天蛾、岡比亞按蚊參與黑化作用的serpin序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)它們的同源

5、性很高。用LPS誘導(dǎo)后不同時(shí)間分別測(cè)定serpin-3的蛋白濃度和PO活性,發(fā)現(xiàn)其濃度在LPS處理后較對(duì)照有所增加,PO活性升高,而在添加Bmserpin-3后,PO活性則有所降低,且隨著添加Bmserpin-3劑量的增加,其PO活性受抑制更明顯,說明Bmserpin-3抑制黑化作用。
　　⑷家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3相互作用蛋白的研究。利用透析純化技術(shù)將獲得的原核表達(dá)重組融合蛋白進(jìn)行純化,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),純化

6、蛋白分子量大小與預(yù)測(cè)的一致,且目的蛋白純度很高,以此蛋白作為誘餌蛋白,用His pull-down方法篩選了與家蠶血液中serpin-3相互作用的蛋白,經(jīng)質(zhì)譜分析,相互作用蛋白為家蠶儲(chǔ)存蛋白(silkworm storage protein),性別特異儲(chǔ)存蛋白2(sex-specific storage-protein2 precursor),主要參與免疫,細(xì)胞凋亡等。
　?、杉倚Qserpin-3靶標(biāo)蛋白的研究。設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA

7、片段,轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞BmN,篩選獲得干擾效果顯著的片段。并將有效片段轉(zhuǎn)染家蠶五齡第三天幼蟲后用熒光定量PCR方法檢測(cè)Bmsp2,3的表達(dá)量。結(jié)果顯示,經(jīng)Bmserpin-3干擾后,Bmsp2表達(dá)量顯著下降,而Bmsp3表達(dá)量有所下降但不顯著。推測(cè)Bmserpin-3或許能通過降低Bmsp2的mRNA水平從而引起sp2蛋白水平下降,而Bmsp3在mRNA的水平變化不大,說明Bmserpin-3沒有影響B(tài)msp3的mRNA水平,可能在轉(zhuǎn)錄