MSTN納米抗體的篩選和功能驗證.pdf

1、本研究以抑制綿羊肌肉生長抑制素（MSTN）的功能為出發(fā)點，通過制備MSTN納米抗體，探究一條有效促進(jìn)動物肌肉生長的新途徑。利用噬菌體展示技術(shù)表達(dá)綿羊 MSTN納米抗體基因文庫，經(jīng)過四輪親和淘選(Panning)獲得 MSTN高特異性的納米抗體片段，利用大腸桿菌表達(dá) MSTN納米抗體并分離純化，在細(xì)胞水平和小白鼠動物試驗中驗證 MSTN納米抗體對肌肉生長作用的影響。主要研究方法與結(jié)果如下：
　　1、綿羊 MSTN的誘導(dǎo)表達(dá)，確定 E

2、LISA包被抗原用量。利用 IPTG在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá) MSTN成熟肽蛋白并純化，通過 ELISA和 Western blot方法檢測抗原反應(yīng)原性，優(yōu)化親和淘選包被抗原蛋白的濃度。
　　2、綿羊 MSTN納米抗體的淘選和鑒定。擴繁 M13K07噬菌體侵染原始文庫，構(gòu)建噬菌體展示抗體文庫，噬菌體文庫容經(jīng)滴度測定達(dá)到1.8×1012 pfu/mL。利用重組 MSTN蛋白抗原對噬菌體抗體庫進(jìn)行富集、篩選，經(jīng)過4輪親和淘選，獲得了一株親

3、和力高、特異性強的陽性克隆，測序后經(jīng) BLAST比對分析證實該克隆序列為駱駝單域重鏈抗體序列。
　　3、 MSTN納米抗體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定。利用 PCR克隆出目的抗體基因序列，構(gòu)建兩種原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) HIS鎳柱純化重組抗體，經(jīng) ELISA和 Western blot驗證其與 MSTN抗原結(jié)合的親和活性和特異性。
　　4、 MSTN納米抗體對小白鼠生長效果研究。通過 MT

4、T細(xì)胞計數(shù)法驗證其對成肌細(xì)胞 C2C12無毒性作用。實驗分組對小白鼠肌肉定量注射納米抗體，比較各試驗組小白鼠體重增長變化，對試驗小白鼠肌肉組織切片和免疫熒光觀察其肌肉形態(tài)學(xué)變化和 MSTN蛋白表達(dá)量變化情況。結(jié)果表明納米抗體可以明顯促進(jìn)小白鼠的體重增長，注射納米抗體的小白鼠肌纖維橫截面積高于未注射納米抗體組和對照組，表明 MSTN納米抗體對肌肉生長具有明顯促進(jìn)作用。綜上所述，本研究通過四輪親和淘選成功篩選到駝源綿羊 MSTN納米抗體，并