MSTN納米抗體的篩選和功能驗(yàn)證.pdf

1、本研究以抑制綿羊肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）的功能為出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)制備MSTN納米抗體，探究一條有效促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)的新途徑。利用噬菌體展示技術(shù)表達(dá)綿羊 MSTN納米抗體基因文庫(kù)，經(jīng)過(guò)四輪親和淘選(Panning)獲得 MSTN高特異性的納米抗體片段，利用大腸桿菌表達(dá) MSTN納米抗體并分離純化，在細(xì)胞水平和小白鼠動(dòng)物試驗(yàn)中驗(yàn)證 MSTN納米抗體對(duì)肌肉生長(zhǎng)作用的影響。主要研究方法與結(jié)果如下：
　　1、綿羊 MSTN的誘導(dǎo)表達(dá)，確定 E

2、LISA包被抗原用量。利用 IPTG在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá) MSTN成熟肽蛋白并純化，通過(guò) ELISA和 Western blot方法檢測(cè)抗原反應(yīng)原性，優(yōu)化親和淘選包被抗原蛋白的濃度。
　　2、綿羊 MSTN納米抗體的淘選和鑒定。擴(kuò)繁 M13K07噬菌體侵染原始文庫(kù)，構(gòu)建噬菌體展示抗體文庫(kù)，噬菌體文庫(kù)容經(jīng)滴度測(cè)定達(dá)到1.8×1012 pfu/mL。利用重組 MSTN蛋白抗原對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集、篩選，經(jīng)過(guò)4輪親和淘選，獲得了一株親

3、和力高、特異性強(qiáng)的陽(yáng)性克隆，測(cè)序后經(jīng) BLAST比對(duì)分析證實(shí)該克隆序列為駱駝單域重鏈抗體序列。
　　3、 MSTN納米抗體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定。利用 PCR克隆出目的抗體基因序列，構(gòu)建兩種原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) HIS鎳柱純化重組抗體，經(jīng) ELISA和 Western blot驗(yàn)證其與 MSTN抗原結(jié)合的親和活性和特異性。
　　4、 MSTN納米抗體對(duì)小白鼠生長(zhǎng)效果研究。通過(guò) MT

4、T細(xì)胞計(jì)數(shù)法驗(yàn)證其對(duì)成肌細(xì)胞 C2C12無(wú)毒性作用。實(shí)驗(yàn)分組對(duì)小白鼠肌肉定量注射納米抗體，比較各試驗(yàn)組小白鼠體重增長(zhǎng)變化，對(duì)試驗(yàn)小白鼠肌肉組織切片和免疫熒光觀察其肌肉形態(tài)學(xué)變化和 MSTN蛋白表達(dá)量變化情況。結(jié)果表明納米抗體可以明顯促進(jìn)小白鼠的體重增長(zhǎng)，注射納米抗體的小白鼠肌纖維橫截面積高于未注射納米抗體組和對(duì)照組，表明 MSTN納米抗體對(duì)肌肉生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用。綜上所述，本研究通過(guò)四輪親和淘選成功篩選到駝源綿羊 MSTN納米抗體，并