蛤仔(Ruditapes philippinarum)噬菌體型溶菌酶基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、蛤仔廣泛養(yǎng)殖于歐洲和亞洲海域,是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類。然而,隨著近年來的擴(kuò)大生產(chǎn)和環(huán)境惡化,以及各類微生物引起的蛤仔疾病,嚴(yán)重威脅到了蛤仔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展。因此,更好地了解蛤仔免疫反應(yīng)機(jī)制可以為蛤仔健康管理與養(yǎng)殖已經(jīng)病害的防治提供新的方向。
　　與其他無脊椎動(dòng)物相同,蛤仔非特異性免疫因子在抵抗外來病原的入侵中起重要作用。而生物體內(nèi)的溶菌酶在先天性免疫中起到了舉足輕重的作用,能夠引發(fā)和維持機(jī)體免疫的防御過程。溶菌酶還

2、起到了誘導(dǎo)其它免疫防御因子的合成與分泌,并協(xié)同其它免疫因子一起進(jìn)行免疫的作用,這對(duì)于以先天性免疫防御為主的無脊椎動(dòng)物是極其重要的一部分。
　　本研究為首次在蛤仔(Ruditapes philippinarum)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并確定噬菌體型溶菌酶;在現(xiàn)有研究中,這也是迄今為止首次于真核生物中發(fā)現(xiàn)噬菌體型溶菌酶。實(shí)驗(yàn)以我國重要海水養(yǎng)殖貝類蛤仔為研究對(duì)象,開展了蛤仔噬菌體型溶菌酶基因(RpLysBp)的克隆和體外重組表達(dá)研究,并以四種病原物刺

3、激蛤仔,揭示了其對(duì)蛤仔噬菌體型溶菌酶基因表達(dá)的影響,初步探索了噬菌體型溶菌酶對(duì)于幾種常見細(xì)菌的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　第一,利用 EST蛤仔噬菌體型溶菌酶基因全長(zhǎng)828bp(GenBank登錄號(hào):KJ427777),包括462bp開放閱讀框序列(ORF),27bp5’端非編碼區(qū)(5’-UTR)和339bp3’端非編碼區(qū)(3’-UTR),包括一個(gè)多聚腺苷酸信號(hào)序列(AATAAA)和ploy A尾巴,編碼154個(gè)氨基酸,推導(dǎo)蛋白

4、分子量(Mw)為17.46kDa,等電點(diǎn)(pI)為7.10,使用SignalP軟件分析顯示重組蛋白的N末端無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。從多序列比對(duì)分析結(jié)果看出,該基因具有噬菌體溶菌酶基因家族的一些保守功能位點(diǎn):Glu20,Asp29和Thr35。序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因與已知的噬菌體內(nèi)溶菌酶基因序列同源性較高(29-42％),初步推斷該序列屬于噬菌體型溶菌酶基因。
　　第二,采用實(shí)時(shí)熒光定量方法分析基因在不同組織的表達(dá)情況,結(jié)果表明RpLysB

5、p的組織表達(dá)有所差異,RpLysBp在蛤仔血細(xì)胞中基因表達(dá)水平最高,其次為外套膜、閉殼肌和腮,消化腺中基因表達(dá)水平表現(xiàn)最低。在刺激表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,將一定濃度的四種病原物:脂多糖LPS-PG、肽聚糖PGN、Rp-葡聚糖WGP、病毒雙鏈RNA Poly(I:C),注射于試驗(yàn)用蛤仔內(nèi)臟團(tuán),刺激后蛤仔鰓組織中RpLysBp基因mRNA表達(dá)量均表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。結(jié)果顯示,LPS處理組在12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,是PBS空白對(duì)照組的5倍(P<0.05

6、),從12 h到72 h表達(dá)量逐漸下降; PGN處理組在3h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,時(shí)空白對(duì)照組的2.5倍(P<0.05),從3h到72h表達(dá)量逐漸下降;Poly(I:C)處理組在6h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,是空白組的5倍(P<0.05),從6h到72h表達(dá)量逐漸下降;WGP處理組在6h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,是空白組的5倍(P<0.05),從6h到72h表達(dá)量逐漸下降。
　　第三,將蛤仔RpLysBp序列連接到帶有組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體pET-30

7、a,成功構(gòu)建了pET-30a-ORF原核表達(dá)質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌株后,IPTG(終濃度為1mmol/L)誘導(dǎo),35℃條件下振蕩培養(yǎng)4h后,得到大量融合蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析后,確認(rèn)所獲得的重組蛋白在17.5kDa左右,與預(yù)測(cè)蛋白大小接近。
　　最后,我們使用三引物測(cè)序法研究了五種殼色蛤仔的噬菌體型溶菌酶基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),所得的基因型數(shù)據(jù)利用PopGen32統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示, SNP235、 SNP28