黑曲霉JMU--TS528菌株的α--L--鼠李糖苷酶基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、橐簍大學(xué)碩士學(xué)位論文黑曲霉JMUTS528菌株的僅L鼠李糖苷酶基因的克隆和表達(dá)分析CloningandExpressionAnalysisof一■_■JI●●■oaLrnamnoSlaaSeIjenetrom月Spe乃舅“，oS刀埏，eI廠JMUTS528論文答辯日期：壟Q!壘生魚旦墨旦黑曲霉JMUTS528菌株的aL鼠李糖苷酶基因的克隆和表達(dá)分析摘要黑曲霉作為重要的酶制劑生產(chǎn)菌種，是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局允許使用的食品用酶生產(chǎn)菌，它能

2、合成一種具有很高商業(yè)價(jià)值的水解酶叫L鼠李糖苷酶。目前黑曲霉菌株的aL鼠李糖苷酶產(chǎn)量低、發(fā)酵成本高，且黑曲霉產(chǎn)aL鼠李糖苷酶需要誘導(dǎo)物，同時(shí)受到碳源代謝的調(diào)節(jié)。本文結(jié)合重疊PCR和RACE技術(shù)克隆了黑曲霉中的aL鼠李糖苷酶基因(Lrha)，通過建立SYBRGreen實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)體系和方法探索了黑曲霉中Lrha和葡萄糖抑制基因(CreA)的表達(dá)情況，同時(shí)構(gòu)建了可持續(xù)表達(dá)a—L鼠李糖苷酶的基因工程菌。主要結(jié)果如下：1克隆到編碼黑曲霉JM

3、U—TS528中0【L鼠李糖苷酶的cDNA(KC7509081)，命名為L(zhǎng)rha。該序列長(zhǎng)2062bp，3’非編碼區(qū)長(zhǎng)94bD，最大開放閱讀框的堿基數(shù)為1968，可編碼655個(gè)氨基酸，117個(gè)氨基酸是信號(hào)肽。L—rha與白曲霉(AB3742671)和黑曲霉51388(煳0013890491)中葉L鼠李糖苷酶基因相似度很高，分別為93％和91％；根據(jù)同源建模的結(jié)果可知，它的空間結(jié)構(gòu)和GH78家族的CtL鼠李糖苷酶相似，具有該家族典型的(“

4、a)6barrel桶狀結(jié)構(gòu)。2黑曲霉JlvlUTS528在以柚皮苷、橘皮苷、蕓香苷和鼠李糖為唯一碳源時(shí)可分泌葉L鼠李糖苷酶，以葡萄糖為唯一碳源時(shí)檢測(cè)不到QL鼠李糖苷酶活性。檢測(cè)黑曲霉中的Lrha和CreA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加葡萄糖后，黑曲霉JIVlUTS528發(fā)酵產(chǎn)物中的葉L鼠李糖苷酶活性降低，Lrha表達(dá)量降低，CreA表達(dá)量上升。3將Lrha連接到表達(dá)載體pET32a和pPIC9K，構(gòu)建重組載體pETrha和pPIC9Kr

5、ha，分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)和畢赤酵母GSll5進(jìn)行表達(dá)。在兩種表達(dá)系統(tǒng)中都能誘導(dǎo)出重組蛋白，但大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)出的是包涵體形式的蛋白，沒有檢測(cè)到小L鼠李糖苷酶活性；畢赤酵母工程菌GSll5誘導(dǎo)表達(dá)7d后，酶活達(dá)到7119U／mL。4重組QL鼠李糖苷酶的最適pH為6O，最適溫度600C，能夠水解袖皮苷、橘皮苷、蕓香苷、楊梅苷及pNPR。1、lo和100mmol／L的Mg、Zn2、Ca2、Cu2、C02、Ni2

6、和K對(duì)重組酶有促進(jìn)作用，l和10m_n[10l／L的Na、葡萄糖、L鼠李糖、EDTA、DTT，10和100mmoI／L的Fe3，1mmol／L的Mn2、10砌【mI／L的SDS、100mmol／L的Fe2十，以及B巰基乙醇(1％、01％)對(duì)該酶有較強(qiáng)的抑制的作用。以柚皮苷為底物，在500C、pH50、20mmol／L的檸檬酸鹽緩沖體系中測(cè)得重組酶的Km為004mmol／L、Vmax為81193U／mg。關(guān)鍵詞黑曲霉，葉L一鼠李糖苷酶，表