多殺性巴氏桿菌HN06株新型免疫蛋白的鑒定及PGAM免疫功能研究.pdf

1、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種廣泛流行于世界各地的病原菌，自然宿主十分廣泛。在豬群中能夠引起豬萎縮性鼻炎（Atrophic rhinitis，AR）和豬肺疫(Swine plague，SP)，在禽、牛、羊以及家兔等動物中會引起出血性敗血癥(Haemorrhagic septicaemia,HS)，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。目前預防多殺性巴氏桿菌以免疫接種為主，疫苗類型主要分為以下幾種:強毒滅

2、活疫苗，弱毒活疫苗，亞單位疫苗。這些疫苗能在一定程度上對多殺性巴氏桿菌起到預防的作用，但是多殺性巴氏桿菌血清型很多，不同血清型菌株之間缺乏相互交叉的免疫保護，導致目前應用的疫苗免疫效果不夠理想。隨著分子生物學技術的廣泛應用，利用病原菌的抗原蛋白制備的亞單位疫苗是當前疫苗研究熱點，亞單位疫苗的理想抗原應該具有:抗原性高，免疫原性強，安全性高等特點。以往理想抗原的篩選較為困難，隨著蛋白組學技術:2-DE電泳和質譜分析技術的發(fā)展，尤其是結合免

3、疫印跡技術的免疫蛋白組學為篩選新型免疫保護性抗原，應用于研制新型高效亞單位疫苗提供了重要途徑。蛋白組學技術的開發(fā)為尋找新型藥物靶點、亞單位疫苗、微生物毒力因子等提供了快速方便的手段。因此，我們針對具有代表性的產PMT毒素血清D型多殺性巴氏桿菌HN06株的細菌表面蛋白進行免疫蛋白組學篩選，希望找到功能重要的免疫原性蛋白，為開發(fā)新型巴氏桿菌疫苗或研究其免疫機理作鋪墊，本研究主要結果如下:
　　1.HN06株表面免疫蛋白的篩選
　

4、　利用雙向電泳將提取的多殺性巴氏桿菌HN06株表面蛋白進行分離，同時使用已制備好的感染血清、陰性對照血清與2-DE分離的表面蛋白進行Western blot雜交，將篩選到的陽性反應點進行質譜分析鑒定。本研究質譜分析共鑒定了4個新型免疫蛋白，分別為:三甲基胺-N-氧化還原酶(Trimethylamine-N-oxide reductase，TorA);延伸因子TS(Elongation factor Ts，EF-Ts);磷酸甘油變位酶(P

5、hosphoglyceromutase，PGAM);過氧化物酶(Peroxiredoxin，Prx)。這4個蛋白均是在巴氏桿菌免疫蛋白組學研究中首次被發(fā)現。
　　2.PGAM蛋白的表達與純化
　　PGAM為細菌產能代謝糖酵解關鍵酶，在細菌各種代謝途徑中通過調控丙酮酸的生成從而控制三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle，TCA)，進而調控細菌的生長與繁殖。本研究利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，對PGAM蛋白基因

6、gpmA與表達質粒pET-30a進行重組載體pET-30a-gpmA的構建:再導入原核表達菌株BL21。原核大量表達后，利用鑷柱純化表達的目的蛋白。將純化后的蛋白與先前制備的感染血清進行Western blot，檢測原核表達蛋白PGAM的生物活性，結果表明原核表達PGAM蛋白具有免疫活性。
　　3.PGAM的免疫性及功能研究
　　本研究通過PGAM蛋白對HN06株生長狀況影響進行測定，發(fā)現PGAM蛋白能夠促進細菌的生長;PG