青藏高原多殺性巴氏桿菌ompH基因敲除株構(gòu)建及部分生物學(xué)功能研究.pdf

1、多殺性巴氏桿菌（Pasteuralla multocida，P.multocida）是青藏高原牦牛出血性敗血癥的病原菌，但其毒力因子和致病機(jī)制尚不清楚。H蛋白（OmpH）是Pm外膜蛋白中的重要組分，對(duì)Pm的致病力和侵襲力至關(guān)重要。本研究前期從青海省牦牛源強(qiáng)毒株P(guān)0910中克隆并表達(dá)了OmpH，發(fā)現(xiàn)重組OmpH對(duì)小鼠可產(chǎn)生90％的保護(hù)力，是一種重要的免疫保護(hù)性蛋白，而OmpH蛋白是否參與P.multocida對(duì)細(xì)胞的粘附，入侵及對(duì)宿主的致

2、病過(guò)程則有待于進(jìn)一步研究。
　　本研究根據(jù)GenBank（登錄號(hào)：NC017027）中多殺性巴氏桿菌HN06設(shè)計(jì)ompH基因上下游引物，對(duì)青藏高原牦牛多殺性巴氏桿菌分離株P(guān)0910、標(biāo)準(zhǔn)菌株C47-8以及疫苗菌株C45-2的ompH基因上下游基因序列分別進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、克隆，并連接到pEX18AP質(zhì)粒上，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEX18AP-ompH。然后將重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化入分離株P(guān)0910、標(biāo)準(zhǔn)菌株C47-8以及疫苗菌株C45-

3、2中，通過(guò)同源重組和負(fù)篩選技術(shù)成功構(gòu)建并篩選出這3株多殺性巴氏桿菌ompH基因缺失株，為鑒定P.multocida ompH基因的功能，開(kāi)展P.multocida粘附，入侵，毒力和免疫等機(jī)制研究搭建了技術(shù)平臺(tái)。
　　在此基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)、外試驗(yàn)比較親本株和ompH基因缺失株對(duì)Vero細(xì)胞的粘附能力和對(duì)小鼠的毒力差異。結(jié)果表明，P0910分離株對(duì)Vero細(xì)胞的粘附能力最高，約每細(xì)胞粘附有32個(gè)細(xì)菌左右，標(biāo)準(zhǔn)菌株C47-8和疫苗株C4

4、5-2粘附能力相似，約每細(xì)胞粘附有20個(gè)細(xì)菌左右，ompH基因缺失后，突變株對(duì)VERO細(xì)胞的附著能力顯著下降，約每細(xì)胞粘附有2個(gè)細(xì)菌左右；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證明對(duì)小鼠的毒力也明顯降低，親本菌株10個(gè)細(xì)菌劑量下攻毒對(duì)小鼠致死，三株ompH基因缺失菌株在107個(gè)細(xì)菌劑量下攻毒小鼠依然存活。說(shuō)明ompH基因有可能是多殺性巴氏桿菌的關(guān)鍵毒力基因之一，在P.multocida侵入宿主并對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行粘附的過(guò)程中起著重要作用。為闡釋P.multocida的