阿爾巴斯白絨山羊不同種類成體干細(xì)胞對轉(zhuǎn)基因克隆效率影響的研究.pdf

1、阿爾巴斯白絨山羊作為內(nèi)蒙古自治區(qū)經(jīng)濟(jì)價值很高的家畜品種之一，其轉(zhuǎn)基因新品種的培育及規(guī)?；敝硨Ξ?dāng)代畜牧業(yè)發(fā)展具有重大的意義。當(dāng)前轉(zhuǎn)基因新品種培育的主要技術(shù)是轉(zhuǎn)基因克隆。成纖維細(xì)胞是目前阿爾巴斯白絨山羊轉(zhuǎn)基因新品種培育中使用最多的核供體細(xì)胞，它的一個顯著的不足之處是體外傳代培養(yǎng)數(shù)目有限、基因轉(zhuǎn)染效率偏低，這一缺點(diǎn)已成為其轉(zhuǎn)基因新品種培育的瓶頸。本研究對分別以阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stemcell

2、s，ADSCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Muscle-derived satellite cells，MDSCs)作為核供體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因克隆研究，觀察不同類型的成體干細(xì)胞對轉(zhuǎn)基因克隆效率的影響，為成功培育阿爾巴斯白絨山羊轉(zhuǎn)基因新品種提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　一、阿爾巴斯白絨山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs建系
　　1.ADSCs分離培養(yǎng)及鑒定

3、r>　　利用Ⅰ型膠原酶消化法對ADSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，細(xì)胞免疫組織化學(xué)法對分離得到的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記鑒定，通過成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)、成肌誘導(dǎo)和成胰島β細(xì)胞誘導(dǎo)對其多能性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:ADSCs在體外增殖穩(wěn)定，經(jīng)Vimentin、CD49d、CD44和CD13染色呈陽性，CD34、CD106呈陰性。經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)、成肌誘導(dǎo)和成胰島細(xì)胞誘導(dǎo)后ADSCs形態(tài)發(fā)生明顯變化，并表達(dá)NSE、fast musclemyosin和insulin，結(jié)果表

4、明ADSCs具備向三胚層細(xì)胞分化的能力。
　　2.BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定
　　利用機(jī)械沖洗法對股骨中BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，利用細(xì)胞免疫組織化學(xué)法對分離得到的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記鑒定，通過成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)對其多能性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:通過貼壁培養(yǎng)法，可使低豐度的BMSCs在體外實(shí)現(xiàn)分離擴(kuò)增并且表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD73，經(jīng)過多次傳代后仍無明顯的衰老現(xiàn)象。BMSCs經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后均表達(dá)NSE和

5、Osteocalcin，具有相應(yīng)的分化能力。
　　3.MDSCs分離培養(yǎng)及鑒定
　　利用二次酶消化法分離培養(yǎng)MDSCs，同樣利用免疫組化法對其進(jìn)行表面標(biāo)記鑒定，利用成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)、成肌誘導(dǎo)和成胰島細(xì)胞誘導(dǎo)對其多能性進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示:MDSCs體外生長迅速，50代后無明顯的老化現(xiàn)象，Desmin、α-Sarcomeric actinin、MyoD1、Myf5和PAX7呈陽性。MDSCs經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)、成肌誘導(dǎo)和成胰島細(xì)胞誘導(dǎo)

6、后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，并表達(dá)NSE、fast muscle myosin及insulin，表明MDSCs具備三胚層分化的多能性。
　　二、阿爾巴斯白絨山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs干性分析
　　1.我們初步探討多能性與干性標(biāo)記分子AKP、IL-6、Nanog、Oct-4、Rex-1、Sox-2和TERT以及三胚層標(biāo)記分子Sox-1、Myod1和Gata-6在阿爾巴斯白絨山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs中的表達(dá)

7、。結(jié)果顯示ADSCs、BMSCs和MDSCs中均表達(dá)AKP、IL-6、Nanog、Oct-4、Rex-1和TERT，而不表達(dá)Sox-2。在ADSCs中，IL-6mRNA表達(dá)量相對較高，Nanog和Oct-4次之，Rex-1和TERT最低（P＜0.01）。在BMSCs中，Rex-1表達(dá)量相對較高，IL-6次之，Oct-4、Nanog和TERT較低(P＜0.01)。在MDSCs中，IL-6、Nanog和Oct-4表達(dá)量相對較高，TERT較低

8、(P＜0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示，在ADSCs、BMSCs和MDSCs中均未檢測到Sox-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄。同時，在這三種細(xì)胞中均檢測到不同程度Sox-1、Myod1和Gata-6的表達(dá)(P＜0.01)，且MDSCs的表達(dá)模式不同于ADSCs和BMSCs。通過Western-blot分析我們發(fā)現(xiàn)，在ADSCs、BMSCs和MDSCs中均未檢測到Sox-2和Rex-1蛋白的表達(dá)，其余五種蛋白Oct-4、Nanog、 AKP、IL-

9、6和TERT均有不同程度的表達(dá)(P＜0.01)，變化趨勢與Q-PCR結(jié)果一致。結(jié)果表明這三種成體干細(xì)胞具有類似于胚胎干細(xì)胞的特性，其中MDSCs干細(xì)胞特性最明顯，是最佳的種子細(xì)胞候選者。
　　2.將阿爾巴斯白絨山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs注射到NOD-SCID小鼠皮下后均未形成三胚層分化附屬物的畸胎瘤組織。結(jié)果表明，阿爾巴斯白絨山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs有鮮明的非致瘤性。
　　三、以阿爾巴斯白絨山羊AD

10、SCs、BMSCs和MDSCs為核供體細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯白絨山羊及鑒定
　?。ㄒ唬┘?xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞多能性檢測
　　以阿爾巴斯白絨胎兒成纖維細(xì)胞(Fetal fibroblast cells，F(xiàn)FCs)為對照，以pCDsRed2-1為外源載體，分別對ADSCs、BMSCs、MDSCs和FFCs進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染并進(jìn)行篩選，同時對篩選得到的細(xì)胞進(jìn)行多能性鑒定。結(jié)果表明:四種細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后瞬時轉(zhuǎn)染效率無明顯差異，但是經(jīng)G41

11、8篩選后ADSCs-pCDsRed2-1、BMSCs-pCDsRed2-1、MDSCs-pCDsRed2-1和FFCs-pCDsRed2-1的熒光克隆形成率分別為78.26％、61.05％、85.40％和50.00％(P＜0.01)。ADSCs-pCDsRed2-1和MDSCs-pCDsRed2-1經(jīng)定向誘導(dǎo)后同樣強(qiáng)表達(dá)NSE、fast musclemyosin和insulin; BMSCs-pCDsRed2-1經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)

12、后均強(qiáng)表達(dá)NSE和Osteocalcin，說明外源基因的整合并不影響阿爾巴斯白絨山羊成體干細(xì)胞的多能性。
　　（二）轉(zhuǎn)基因胚胎的生產(chǎn)及檢測
　　分別以ADSCs-pCDsRed2-1、 BMSCs-pCDsRed2-1、MDSCs-pCDsRed2-1和FFCs-pCDsRed2-1為核供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。分別收取四類不同細(xì)胞來源桑椹胚期轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，通過Q-PCR和Western-blot檢測Ds

13、Red2的表達(dá)量。結(jié)果表明:ADSCs-pCDsRed2-1， BMSCs-pCDsRed2-1和MDSCs-pCDsRed2-1來源的克隆胚胎融合率均較FFCs-pCDsRed2-1來源的胚胎高，8-細(xì)胞率和囊胚率相似。其中MDSCs-pCDsRed2-1融合率最高。在mRNA水平上，ADSCs-pCDsRed2-1、BMSCs-pCDsRed2-1和MDSCs-pCDsRed2-1來源克隆胚胎中DsRed2mRNA含量是FFCs-p

14、CDsRed2-1來源克隆胚胎DsRed2 mRNA含量的2倍以上(P＜0.01)。在蛋白水平上，BMSCs-pCDsRed2-1來源克隆胚胎DsRed2蛋白相對表達(dá)量是FFCs-pCDsRed2-1來源克隆胚胎的1.29倍且差異顯著(P＜0.01);而FFCs-pCDsRed2-1來源克隆胚胎DsRed2蛋白相對表達(dá)量分別是是ADSCs-pCDsRed2-1和MDSCs-pCDsRed2-1來源克隆胚胎的2.13倍和2.71倍。

15、>　　（三）轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯白絨山羊的生產(chǎn)及檢測
　　以4-6枚/只的標(biāo)準(zhǔn)將轉(zhuǎn)基因克隆胚胎移入與排卵點(diǎn)同側(cè)的受體羊的輸卵管中。利用Western-blot方法檢測轉(zhuǎn)基因克隆羔羊背部皮膚中DsRed2的表達(dá)。結(jié)果顯示，通過胚胎移植的方法我們分別得到得到成活的ADSCs-pCDsRed2-1來源轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯白絨山羊2只，MDSCs-pCDsRed2-1來源轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯白絨山羊1只和FFCs-pCDsRed2-1來源轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯白絨

16、山羊1只，并且它們均表達(dá)DsRed2蛋白。
　　綜上所述，本研究首先通過體外分離、培養(yǎng)并建立了阿爾巴斯白絨山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs細(xì)胞系，這三種成體干細(xì)胞在體外增殖能力強(qiáng)、經(jīng)多次傳代后仍保持良好的干細(xì)胞特性和分化潛能。而且與FFCs相比，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后這三類成體干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均明顯高于FFCs的轉(zhuǎn)染效率;同時外源基因的隨機(jī)整合并不影響其多能性。最后，通過將這三類成體干細(xì)胞作為核供體細(xì)胞研究其對轉(zhuǎn)基因克隆效率的影響時