靶除FGF5基因體細(xì)胞克隆絨山羊的研究.pdf

1、FGF5基因是FGF基因家族中的一員，在毛發(fā)生長周期中具有重要的調(diào)控作用。FGF5基因突變可以導(dǎo)致毛發(fā)生長周期中生長期的延長，從而使毛發(fā)的長度增加。本研究擬靶除內(nèi)蒙古白絨山羊的FGF5基因，利用核移植方法創(chuàng)造高產(chǎn)絨量山羊。以我區(qū)的白絨山羊?yàn)閷ο?，建立胎兒皮膚成纖維細(xì)胞系;設(shè)計(jì)pLOX-EGFP-FGF5、RNAi-FGF5、TALEN-FGF5，三種FGF5基因靶除載體;分別將三種敲除載體用脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電轉(zhuǎn)法、轉(zhuǎn)染儀介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染到絨山羊

2、胎兒成纖維細(xì)胞中，篩選陽性細(xì)胞并擴(kuò)繁;以其為核供體構(gòu)建轉(zhuǎn)基因山羊重構(gòu)胚并移植到同步發(fā)情的受體羊輸卵管內(nèi)，制造轉(zhuǎn)基因克隆山羊并鑒定。
　　1.根據(jù)已經(jīng)公布的牛和山羊的FGF5基因序列設(shè)計(jì)引物克隆內(nèi)蒙古白絨山羊的FGF5基因，發(fā)現(xiàn)FGF5基因具有三個外顯子和兩個內(nèi)含子，cDNA長度為924bp。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建合成3種靶除絨山羊FGF5基因的載體，分別為基因打靶載體pLOX-EGFP-FGF5，RNA干擾載體RNAi-FGF5-

3、1＃和RNAi-FGF5-2＃，以及TALEN載體TN000201、TN000202、TN000204。測序及酶切鑒定結(jié)果表明載體構(gòu)建正確并可用。
　　2.采用組織塊種植法分離培養(yǎng)了9個絨山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞系;通過G418敏感度實(shí)驗(yàn)，確定了各個細(xì)胞系的最佳G418篩選濃度，并選擇對G418抗性較好的兩個細(xì)胞系goat6＃和goat9＃作為篩選轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的細(xì)胞系;分別應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電轉(zhuǎn)法、轉(zhuǎn)染儀介導(dǎo)法將3種載體轉(zhuǎn)染到絨山

4、羊胎兒成纖維細(xì)胞中，最終篩選出3種轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系。
　　3.以篩選鑒定得到3種轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系為核供體，分別構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。應(yīng)用基因打靶技術(shù)敲除FGF5基因的轉(zhuǎn)基因克隆胚共同步移植46只受體山羊，妊娠4只，妊娠率為8.7％。1只羔羊存活4天后死亡，2只羔羊出生后幾分鐘死亡，目前健康存活羔羊1只。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)GF5基因的轉(zhuǎn)基因克隆胚共同步移植143只受體山羊，妊娠24只，妊娠率為16.78％，但胎兒均發(fā)生流產(chǎn)。應(yīng)用

5、TALEN技術(shù)敲除FGF5基因的轉(zhuǎn)基因克隆胚共同步移植62只受體山羊，經(jīng)B超檢測發(fā)現(xiàn)有5只受體羊懷孕，妊娠率為8.06％。
　　4.應(yīng)用基因打靶技術(shù)敲除FGF5基因的轉(zhuǎn)基因克隆羔羊經(jīng)PCR鑒定，檢測出編號為083的羔羊發(fā)生了FGF5基因的雙敲除，目前健康狀況良好。其余三只羔羊?yàn)榉寝D(zhuǎn)基因的克隆羊。在應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)GF5基因中，通過實(shí)時熒光定量PCR對流產(chǎn)胎兒進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明這些胎兒FGF5基因的表達(dá)量均發(fā)生了明顯的降低。