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文檔簡介
1、肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN)又稱生長分化因子-8(growthdifferentiation factor8,GDF-8),是一類重要的骨骼肌細(xì)胞生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子,研究表明,該基因的缺失、突變能加速肌肉生長和改變紅白肌的組成比例并增加肌肉量。CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種來源于細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。本研究利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞和肌肉衛(wèi)
2、星細(xì)胞中的MSTN基因進(jìn)行了敲除,并通過實(shí)時(shí)定量PCR與Western blot檢測(cè)了MSTN基因敲除后成纖維細(xì)胞中與之相關(guān)基因的表達(dá)情況,為通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)生產(chǎn)基因編輯動(dòng)物奠定基礎(chǔ)。
1、gRNA表達(dá)載體的設(shè)計(jì)、構(gòu)建與轉(zhuǎn)染效率分析
本實(shí)驗(yàn)通過麻省理工學(xué)院的CRISPR Design(http://crispr.Mit.edu)軟件設(shè)計(jì)4對(duì)長20nt的gRNA,以gRNA-T2為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增得到
3、完整的gRNA(最終PCR產(chǎn)物長度為455bp)。
為了篩選適應(yīng)于山羊細(xì)胞的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件,本研究利用電穿孔法將紅色熒光蛋白表達(dá)載體pCMV-DsRed導(dǎo)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析的結(jié)果表明,最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件為:每1×106個(gè)絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞加入pCMV-DsRed質(zhì)粒10μg(1μg/μL),Opti-MEM90μL,電壓225V,脈沖時(shí)間2.5ms。
利用以上最佳轉(zhuǎn)染條件將hCas9載體和gR
4、NA共同導(dǎo)入阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中,培養(yǎng)48h后提取基因組,設(shè)計(jì)跨打靶位點(diǎn)的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使用Surveyor突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),確定有3個(gè)gRNA敲除效率較高,可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
2、利用CRISPR-Cas9技術(shù)制備MSTN基因敲除絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞和肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的的制備與分析
采用最適合的轉(zhuǎn)染條件,將hCas9載體和gRNA導(dǎo)入阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中和肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中,隨機(jī)挑取
5、單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng),建立單克隆細(xì)胞系。對(duì)每個(gè)單克隆細(xì)胞系的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序,篩選出靶位點(diǎn)發(fā)生突變的單克隆細(xì)胞系。本研究共獲得62個(gè)胎兒成纖維單克隆細(xì)胞系,其中有10個(gè)單等位基因敲除的單克隆細(xì)胞系和10個(gè)雙等位基因敲除的單克隆細(xì)胞系,總敲除效率為32.25%。還獲得了6個(gè)肌肉衛(wèi)星單克隆細(xì)胞系,其中有5個(gè)雙等位基因敲除的陽性單克隆細(xì)胞系,總敲除效率為83.33%。
本研究選取了雙等位基因敲除的陽性成纖維細(xì)胞細(xì)胞系C205,
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